食管鳞癌组织中AMPKα1及磷酸化AMPKα的表达*

郭 幸，刘宗文#，张 艳，郭振江，楚阿兰，宋 锐，侯 歌，袁金金，王 成

1)郑州大学第二附属医院肿瘤放疗科 郑州450014 2)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州450001

食管鳞癌组织中AMPKα1及磷酸化AMPKα的表达*

郭 幸1)，刘宗文1)#，张 艳2)，郭振江1)，楚阿兰1)，宋 锐1)，侯 歌1)，袁金金1)，王 成1)

1)郑州大学第二附属医院肿瘤放疗科 郑州450014 2)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州450001

#通信作者，男，1966年12月生，博士，主任医师，研究方向：肿瘤的放射治疗，E-mail：liuzwhh@sina.com

腺苷酸活化的蛋白激酶；食管癌；能量代谢

目的：探讨腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)在食管鳞癌组织中的表达及临床意义。方法：运用免疫组化SP法，对61 例食管鳞癌患者的癌灶及相应正常食管黏膜组织中AMPKα1和p-AMPKα的表达进行检测。结果：食管鳞癌组织中AMPKα1蛋白阳性表达率与正常食管黏膜组织比较，差异不具有统计学意义(P>0.05)；不同临床病理特征的食管鳞癌组织中AMPKα1蛋白阳性表达率差异亦无统计学意义(P>0.05)。食管鳞癌组织中p-AMPKα蛋白阳性表达率(32.7%)低于正常食管黏膜组织(73.7%)，并且低分化鳞癌组织中p-AMPKα蛋白的阳性表达率低于中高分化组织(P<0.05)。食管鳞癌组织中p-AMPKα和AMPKα1的表达无关联性(rP=0.228，P>0.05)。结论：AMPK信号转导途径异常有可能与食管鳞癌的发生、发展有关。

多项研究[1-2]表明肿瘤细胞中存在能量代谢异常，而腺苷酸活化的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)是能量代谢的调控因子。已有研究[3-4]发现，AMPK与肾细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤的发生发展有密切的关系，各种引起细胞内AMP/ATP比值升高的因素均可促使AMPK活化。AMPK磷酸化活化后抑制消耗ATP的合成代谢过程，启动生成ATP的分解代谢过程，维持机体能量代谢平衡[5-6]。作者应用免疫组化方法检测食管鳞癌组织中AMPKα1及磷酸化AMPKα(p-AMPKα)的表达情况，探讨二者与食管鳞癌之间可能存在的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 组织标本由郑州大学第二附属医院和第一附属医院胸外科提供，来源于2013年11月至2015年11月经手术切除的食管癌患者，共61例，患者在手术前均未接受化疗、放疗以及其他特殊治疗，手术方式均为食管癌根治性手术，病理诊断均由医院病理专家复核确诊为鳞癌。其中男43 例，女18 例；年龄≥60岁者46例，<60岁者15例；中高分化23 例，低分化38 例；29例有淋巴结转移，32 例无淋巴结转移；临床分期为Ⅰ、Ⅱ期46 例，Ⅲ、Ⅳ期15 例；侵及浆膜25例，未侵及浆膜36例。

1.2 AMPKα1及p-AMPKα蛋白的检测 两家医院的标本均在离体30 min内分别于癌灶、癌旁3 cm以外处取材，经病理证实为鳞癌和正常食管黏膜组织。将取下的新鲜组织标本置于40 g/L多聚甲醛中固定并脱水，石蜡包埋，然后连续切片，片厚3～5 μm。免疫组化采用SP法。AMPKα1及p-AMPKα 相关抗体均购自Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔SP二抗试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。严格按照试剂说明书操作。DAB显色并蒸馏水冲洗，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片剂封片。以PBS代替一抗作阴性对照，以已知AMPKα1及p-AMPKα蛋白表达阳性的切片作阳性对照。判定标准[7]：阳性细胞内可出现棕黄色颗粒样物质，主要集中于细胞质。于高倍镜下观察，每张切片随机选取5个视野，计数500个细胞，计算阳性细胞比例，阳性细胞比例<25%为阴性，≥25%为阳性。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0进行统计学分析。正常食管黏膜及食管鳞癌组织中AMPKα1和p-AMPKα阳性表达率的比较采用配对χ2检验，不同临床病理特征食管鳞癌组织中AMPKα1、p-AMPKα阳性表达率的比较采用χ2检验，食管鳞癌组织中p-AMPKα和AMPKα1蛋白表达的关联性分析采用列联系数，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 食管鳞癌和正常食管黏膜组织中AMPKα1和p-AMPKα蛋白的表达情况 AMPKα1和p-AMPKα蛋白均主要表达于细胞质，食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织中两蛋白的表达见图1和表1、2。

A:癌组织p-AMPKα蛋白;B:癌组织AMPKα1蛋白;C:正常组织 p-AMPKα蛋白;D:正常组织AMPKα1蛋白。图1 食管鳞癌和正常食管黏膜组织中AMPKα1和p-AMPKα蛋白的表达情况(SP,×400)

表1 食管鳞癌和正常食管黏膜组织中AMPKα1蛋白的表达情况 例

χ2=3.157，P=0.643。

2.2 AMPKα1和p-AMPKα蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理指标的关系 见表3。

表2 食管鳞癌和正常食管黏膜组织中p-AMPKα蛋白的表达情况 例

χ2=10.015，P=0.014。

2.3 食管鳞癌组织中p-AMPKα与AMPKα1蛋白表达的关联性分析 食管鳞癌组织中p-AMPKα蛋白和AMPKα1蛋白表达无关联性，见表4。

表3 不同临床病理特征的食管鳞癌组织中AMPKα1和p-AMPKα表达的比较 例

表4 食管鳞癌组织中p-AMPKα与AMPKα1蛋白表达的关联性分析 例

rP=0.228，P=0.068。

3 讨论

糖酵解途径和线粒体的有氧氧化是细胞内能量产生的主要方式，肿瘤细胞中能量的产生主要通过糖酵解途径。肿瘤细胞以葡萄糖作为能源物质，其葡萄糖摄取和糖酵解能力维持在较高的水平，以增强其在缺血、缺氧等应激条件下的增殖和存活能力。AMPK广泛存在于真核细胞生物中，为异源三聚体，由α、β和γ亚单位组成，是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。AMPK是体内的能量调节器，在细胞间压力改变、葡萄糖耗竭、缺氧和局部缺血等情况下细胞内AMP/ATP比值增大，可以磷酸化α亚基第172位苏氨酸，从而激活AMPK，活化的AMPK可促进葡萄糖重吸收、糖酵解和脂肪酸氧化，减少脂肪酸、胆固醇和蛋白质的合成，储存能量[8-10]。AMPK的失活可使体内能量代谢及炎症反应失控，促进肿瘤的发生[11]。近年来，诸多研究表明，AMPK具有抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。Woodard等[12-13]应用AMPK激活剂二甲双胍或AICAR处理肾细胞癌细胞后，胞内雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性降低，表明二甲双胍或AICAR可增强他汀类药物对肾细胞癌细胞的细胞毒性，起到一定程度的化疗增敏作用。吴春丽等[14]的研究证实，AICAR可通过激活AMPK信号通路抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖。Cuthbertson等[15]发现，利用合成的脂肪酸合成酶抑制剂激活AMPK，可导致人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的凋亡。AMPK对线粒体的合成、自噬、内源性凋亡均有十分重要的调节作用[16-17]。

该研究对61 例食管鳞癌组织标本及其相应正常黏膜组织进行了AMPKα1与p-AMPKα的检测，结果显示，食管鳞癌组织中AMPKα1蛋白阳性表达率与正常食管黏膜组织比较，差异不具有统计学意义；不同临床病理特征的食管鳞癌组织中AMPKα1蛋白阳性表达率差异亦无统计学意义。但食管鳞癌组织中p-AMPKα蛋白阳性表达率显著低于正常食管黏膜组织；其表达与食管鳞癌患者的年龄、性别、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移无关，但与组织分化程度有关，在低分化鳞癌组织中的阳性表达率低于中高分化组织。该研究并未发现食管鳞癌组织中AMPKα1与p-AMPKα的表达相关。上述结果表明食管鳞癌组织中AMPK信号转导途径异常，可能对食管鳞癌的发展及转归产生影响。

综上所述， AMPK信号转导途径异常与食管鳞癌的形成与发展关系较密切，AMPK信号转导途径因子及其活化机制有可能成为食管癌治疗、抗肿瘤药物研究的新方向。

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(2016-11-08收稿 责任编辑王 曼)

Expressions of AMPKα1 and p-AMPKα in esophageal squamous cell carcinoma tissue

GUOXing1),LIUZongwen1),ZHANGYan2),GUOZhenjiang1),CHUAlan1),SONGRui1),HOUGe1),YUANJinjin1),WANGCheng1)

1)DepartmentofRadiotherapy,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

AMPK；esophageal carcinoma；energy metabolism

Aim: To discuss the expression of adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase(AMPK) in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) tissue and its clinical significance. Methods: The ESCC and normal esophageal mucosal epithelial tissue samples were collected from 61 ESCC patients, and the expressions of AMPKα1 and p-AMPKα were detected by immunohistochemical SP method.Results: The AMPKα1 positive expression rate in ESCC tissue had no significant difference compared with the normal esophageal mucosa tissue(P>0.05),and that among different clinical and pathological characteristics ESCC tissue had no significant difference(P>0.05). The positive expression rate of p-AMPKα in ESCC tissue(32.7%) was lower than that of normal esophageal mucosa tissue(73.7%), and that in poor differentiated ESCC tissue was lower than that in medium and high differentiated tissue(P<0.05). There was no correlation between the expressions of p-AMPKα and AMPKα1 in ESCC tissue(rP=0.228，P>0.05).Conclusion: Abnormal activation of AMPK pathway may be related to the occurrence and development of ESCC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.004

*河南省基础与前沿技术研究计划项目 132300410409；河南省医学科技攻关计划项目(省部共建项目) 201401009;郑州市科技计划项目 131PCXTD628

R735.1