食管鳞癌细胞系TE7放射照射后miRNAs及DNA修复相关因子的表达*

赵晓静，马 军#，袁 翎，王昆仑，李 南，张中冕，孙 佳

1)郑州大学第二附属医院消化内科 郑州 450014 2)郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院放疗科 郑州 450014 3)郑州大学第二附属医院肿瘤科 郑州 450014

食管鳞癌细胞系TE7放射照射后miRNAs及DNA修复相关因子的表达*

赵晓静1)，马 军1)#，袁 翎2)，王昆仑2)，李 南3)，张中冕3)，孙 佳3)

1)郑州大学第二附属医院消化内科 郑州 450014 2)郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院放疗科 郑州 450014 3)郑州大学第二附属医院肿瘤科 郑州 450014

#通信作者，男，1966年8月生，博士，副教授，研究方向：消化道肿瘤，E-mail:843093451@qq.com

食管癌；miR-126；miR-21；miR-101；DNA-PKcs；RAD21；放射照射

目的：探讨食管鳞癌细胞系TE7放射照射后miRNAs及DNA修复相关因子表达的关系。方法：采用实时定量PCR检测不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)X射线照射后TE7中miR-126、miR-21、miR-101、DNA-PKcs mRNA及RAD21 mRNA的表达，蛋白免疫印迹法检测DNA-PKcs和RAD21蛋白的表达。 结果：X射线照射后，随吸收剂量的增加，TE7中miR-126表达逐渐升高(P<0.05)，miR-101表达降低(P<0.05)，DNA-PKcs和RAD21 mRNA表达逐渐升高(P<0.05)；磷酸化DNA-PKcs、总DNA-PKcs及RAD21蛋白表达无明显变化(P>0.05)。当吸收剂量是4 Gy时，TE7细胞中miR-126、miR-101与RAD21蛋白表达呈负相关(r分别为-0.899、-0.853，P均<0.05)。结论：miR-126及miR-101可能通过调节RAD21的表达影响TE7细胞的放疗敏感性。

食管癌死亡率位于所有肿瘤的第6位，5 a生存率小于20%[1]。放疗是进展期食管癌主要的治疗方法，其主要通过诱导DNA双链断裂来杀伤细胞，而DNA双链断裂的修复通常导致治疗失败，抑制DNA损伤修复可提高癌细胞的放疗敏感性[2]。DNA 双链断裂修复主要有非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组(homologous recombination repair,HRR)两条途径。DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)是哺乳动物细胞中参与NHEJ的主要分子之一，由Ku70、Ku80、DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)3个亚基组成，其中DNA-PKcs是中心因子，在DNA断裂修复中起着重要作用[3-4]。RAD21是凝集复合体的一个组分，凝集复合体参与姐妹染色单体的结合、DNA双链断裂的修复及细胞周期的调控[5]。RAD21可以直接或间接地促进HRR[6]。microRNA(miRNA)作为一种内源性小单链非编码RNA，一般包含18～25个核苷酸，其主要通过与RNA介导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合形成非对称的复合物，再与靶基因mRNA的3’-非编码区域(UTR)结合，从降解靶基因mRNA或者抑制靶基因转录后翻译的角度调控靶基因的表达[7-9]，其参与许多生理和病理性进程，包括放疗相关的信号通路[10]。作者用X射线照射食管鳞癌细胞系TE7，观察照射前后DNA修复相关因子DNA-PKcs、RAD21以及miR-101、miR-21、miR-126表达的变化，探讨miRNAs与TE7放疗敏感性的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及分组处理 TE7细胞由课题组实验室保存，用6 cm培养皿，含体积分数10%新生牛血清、青链霉素(各100 U/mL)的RPMI 1640培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。细胞生长至对数期时，分5组进行X射线(瑞典医科达公司直线加速器，型号：Synergy,速率2 Gy/min)照射，吸收剂量分别为0、2、4、6和8 Gy，照射24 h后进行指标检测。每个指标重复检测3次。

1.2 细胞中mRNAs和miRNAs的检测 采用Trizol法(Invitrogen公司)提取细胞总RNA，行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察完整性。miRNAs引物购于GenePharma公司，mRNAs引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。根据Thermo Scientific试剂盒说明书进行反转录，所有操作均在冰上进行。PCR反应体系为20 μL,包括2×qPCR Master Mix(SYBR) 10 μL、10 μmol/L引物0.4 μL、5 U/μL Taq DNA 多聚酶0.2 μL、模板cDNA 3 μL，双蒸水补足至20 μL。采用ABI PRISM 7500 PCR仪进行扩增。mRNAs反应条件为：95 ℃ 15 min,94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,40个循环。miRNAs反应条件为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s,62 ℃ 40 s,40个循环。miRNAs的表达水平用内参U6 snRNA标准化，DNA-PKcs和RAD21 mRNA的表达水平用内参β-actin标准化，用 2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表1 引物序列

1.3 细胞中DNA-PKcs、RAD21蛋白的检测 用蛋白裂解液提取细胞中的蛋白[11]。用1×裂解液制备蛋白样品，(50～160) g/L梯度分离胶电泳，转膜12 h×250 mA。体积分数5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，加一抗4 ℃振荡过夜孵育。磷酸化DNA-PKcs(p-DNA-PKcs)和RAD21抗体购于Abcam公司，总DNA-PKcs(t-DNA-PKcs)购于Cell Signaling Technology公司，p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs、RAD21抗体稀释度均为1:3 000，内参β-actin抗体稀释度为1:5 000。然后TBST洗膜3次，二抗孵育60 min，洗膜3次后ECL染色，用FluorChem FC3成像仪采集图像，进行灰度分析，计算目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理 用SPSS 17.0进行数据分析，5组间各指标的比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，检验指标之间的相关性采用Pearson相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 5组TE7细胞中miRNAs及mRNAs的表达情况 见表2。随照射剂量的增大，TE7细胞中miR-126、DNA-PKcs mRNA和RAD21 mRNA的表达逐渐升高，miR-101的表达降低。

表2 5组TE7细胞中miRNAs及mRNAs的表达

*：与0 Gy组比较，P<0.05；#：与2 Gy组比较，P<0.05；△：与4 Gy组比较，P<0.05；▲：与6 Gy组比较，P<0.05。

2.2 5组TE7细胞中DNA-PKcs及RAD21蛋白的表达情况 5组TE7细胞中p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs、RAD21蛋白的表达差异无统计学意义，见图1、表3。

图1 5组TE7细胞中DNA-PKcs及RAD21蛋白的表达

表3 5组TE7细胞中DNA-PKcs及RAD21蛋白的表达

2.3 放射照射后TE7细胞中miR-126、miR-21和miR-101水平与DNA修复蛋白表达的相关性分析 采用Pearson相关分析发现，当吸收剂量为4 Gy时，miR-126、miR-101与RAD21蛋白的表达呈负相关，r分别为-0.899(P=0.008)、-0.853(P=0.019)。

3 讨论

食管癌的放疗抵抗是导致治疗失败的主要原因，因此提高癌细胞的放射敏感性可提高食管癌的治疗效果。放疗抵抗的主要机制之一是PI3K/Akt信号通路的过度激活，AKT可激活DNA-PKcs，从而促进DNA双链断裂的修复，降低肿瘤细胞的放射敏感性[2]。Toulany等[12]研究发现双重作用于PI3K 和MEK可以增强A549 和H460 细胞的放疗敏感性。DNA-PK中的Ku70、Ku80是组成Ku蛋白的调节亚基，在DNA双链断裂修复中起着辨认、结合排列DNA末端并募集催化亚基DNA-PKcs的作用。DNA-PKcs可磷酸化LigaseⅣ、XRCC4，从而使得后者发挥连接双链断裂DNA的作用。肿瘤细胞中任意一个组分缺陷均可导致DNA-PK活性丧失，而致放射敏感性增强[4]。RAD21最初在酵母粟酒中被发现，其可以保持姐妹染色单体的结合并确保复制染色体正确分离并进入子细胞，可以直接或间接地促进HRR[6]。de Andrade等[11]发现放射照射后胶质瘤细胞中DNA-PKcs的表达显著升高。Yang等[13]发现肝癌细胞HepG2 中DNA-PKcs 蛋白表达升高，60Co γ电离辐射可进一步增强DNA-PKcs的表达，而DNA-PK抑制剂NU7441能够增强 HepG2 细胞的放疗敏感性。Bauerschmidt等[5]发现10 Gy X射线照射后，宫颈癌细胞中RAD21表达升高。该研究结果显示， X射线照射后，食管鳞癌细胞TE7中DNA-PKcs和RAD21 mRNA表达水平升高，且两者的表达随照射剂量的增大而增加，但在蛋白水平上并没有显示出这种效应。

miRNA是一类非编码的小RNA，可绑定多个靶向mRNAs的3′-UTR，通过阻断靶基因翻译或下调靶基因表达，参与细胞分化、增殖、凋亡、代谢、死亡等过程的调控[14]。因此识别并调控针对DNA双链断裂修复的miRNAs，有可能提高肿瘤细胞的放疗敏感性。该研究对X射线照射后TE7细胞中miR-101、miR-21、miR-126的表达进行了检测。

Nie等[15]的研究结果显示，人食管鳞癌组织中miR-126低表达，miR-126可通过调节PI3K/AKT信号通路抑制EC109细胞的增殖和迁移。Templin和Vincenti等[16-17]发现放疗后患者外周血中miR-126表达升高，提示其可以作为放疗敏感性的一个标志物。Yan等[18]用荧光素酶报告法证明了miR-101可通过靶向调节DNA-PKcs和ATM来增强肺癌细胞株的放疗敏感性。该研究结果显示，X射线照射后食管鳞癌细胞TE7中miR-126表达升高，miR-101表达降低，且两者的表达随照射剂量的增大而变化；当吸收剂量为4 Gy时，TE7中miR-101、miR-126与RAD21蛋白表达均呈负相关，与p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs的表达无相关性，提示miR-126及miR-101可能通过调节HRR通路蛋白RAD21的表达影响TE7细胞的放疗敏感性。

综上所述，该研究发现X射线照射后TE7细胞存在放射性抵抗现象，DNA-PKcs mRNA及RAD21 mRNA表达升高。miR-126及miR-101可能通过调节HRR通路蛋白RAD21的表达来影响TE7细胞的放疗敏感性，这为食管癌的临床治疗提供了新思路。

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(2016-11-18收稿 责任编辑王 曼)

Expressions of miRNAs and DNA damage repair factors in esophageal squamous cell carcinoma cell line TE7 after X-ray radiation

ZHAOXiaojing1),MAJun1),YUANLing2),WANGKunlun2),LINan3),ZHANGZhongmian3),SUNJia3)

1)DepartmentofDigestiveDiseases,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofRadiotherapy,theAffiliatedCancerHospital,ZhengzhouUniversity;HenanProvincialCancerHospital,Zhengzhou450014 3)DepartmentofOncology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

esophageal carcinoma;miR-126；miR-21；miR-101；DNA-PKcs；RAD21；radiation

Aim: To explore the expressions of miRNAs and DNA repair factors in esophageal squamous cell carcinoma cell line TE7 after radiation. Methods: Real-time PCR was used to detect the expressions of miR-126, miR-21, miR-101, DNA-PKcs, and RAD21 mRNA in TE7 cells treated with different doses(0, 2, 4, 6, 8 Gy) of X-ray radiation, and Western blot was used to detect the expressions of DNA-PKcs and RAD21 protein. Results: In TE7 cells treated with X-ray radiation, the expressions of miR-126, DNA-PKcs and RAD21 mRNA were up-regulated with the dose increasing(P<0.05), that of miR-101 was down-regulated (P<0.05), and the expressions of phospho-DNA-PKcs, total DNA-PKcs and RAD21 protein had no statistical changes(P>0.05). The expressions of miR-126 and miR-101 were negatively correlated with that of RAD21 protein(r=-0.899,-0.853，P<0.05) in TE7 cells treated with 4 Gy radiation.Conclusion: MiR-126 and miR-101 may influence the radio-sensitivity of TE7 cells by regulating the expression of RAD21.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.002

*河南省科技厅科技攻关项目 152300410164

R735.1