α-细辛醚诱导的Eca-109细胞中cytC、bax的表达*

张 妍,韩倩倩,朱艳琴

河南中医药大学基础医学院 郑州 450046

α-细辛醚诱导的Eca-109细胞中cytC、bax的表达*

张 妍,韩倩倩,朱艳琴#

河南中医药大学基础医学院 郑州 450046

#通信作者，女，1956年11月生，硕士，教授，研究方向:中药抗肿瘤，E-mail:jc.zyqin@163.com

α-细辛醚；细胞色素C；bax；Eca-109 细胞

目的：观察α-细辛醚对食管癌Eca-109细胞凋亡及cytC、bax表达的影响，探讨其诱导细胞凋亡的机制。方法：体外培养人食管癌Eca-109细胞，以15 mmol/L 5-氟尿嘧啶(5-FU)和25、50、100 mg/L的α-细辛醚干预48 h后，DAPI染色、倒置荧光显微镜下观察细胞形态，MTT检测细胞增殖情况，Annexin V-PI法检测细胞凋亡率，分别采用Western blot和实时荧光定量PCR法检测cytC、bax mRNA及蛋白的表达。以无干预细胞作空白对照。结果：与空白对照组比较，α-细辛醚组和5-FU组细胞的增殖能力降低，凋亡率升高(P<0.05)，细胞中cytC、bax蛋白及mRNA相对表达量均升高(P<0.05)。结论：α-细辛醚可能通过上调线粒体通路cytC、bax的表达，抑制Eca-109细胞增殖，促进其凋亡。

食管癌是消化系统常见恶性肿瘤，其发生发展是一个多因素、 多阶段、 多基因变异积累及相互作用的复杂过程[1]。近来研究[2]表明，化疗药物多是通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。线粒体作为细胞凋亡调控的活动中心，可通过开放线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)促进肿瘤细胞凋亡，因而线粒体途径的凋亡基因调控备受关注。α-细辛醚是天南星科植物石菖蒲挥发油的主要成分，具有镇静、解痉、催眠、抗惊厥等功效[3]。有关α-细辛醚抗肿瘤作用的研究甚少。作者通过观察α-细辛醚对体外培养人食管癌Eca-109细胞增殖和凋亡的影响，检测细胞色素C(cytochrome C，cytC)、bax mRNA和蛋白的表达情况，探讨α-细辛醚诱导Eca-109细胞凋亡的作用靶点及机制，为α-细辛醚的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 Eca-109购于南京凯基生物科技发展有限公司。α-细辛醚为山西普德药业股份有限公司产品，2 mg/支；5-氟尿嘧啶(5-FU)为上海旭东海普药业有限公司产品，规格2 g/L、10 mL/支；四甲基偶氮唑盐(MTT)为美国Sigma公司产品；胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)为美国Solarbio公司产品; 胎牛血清为天津灏洋公司(TBD)产品；DAPI和Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒为南京凯基生物技术有限公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒为上海索莱宝生物科技有限公司产品； cytC、bax兔抗人单克隆抗体为英国Abcam公司产品；HRP标记的羊抗兔二抗工作液为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒为宝生物工程大连有限公司产品；引物由北京市理化分析测试中心合成。流式细胞仪购自美国 Beckman Coulter公司；CO2恒温培养箱购自德国Heraeus公司；垂直电泳仪、转膜仪购自美国Savant公司。

1.2 细胞培养 Eca-109细胞复苏后，常规培养于含体积分数10%胎牛血清、链霉素100 U、青霉素100 U的RPMI 1640培养液中，在体积分数5% CO2、37 ℃、相对湿度为95%的培养箱中进行培养，3～4 d传代1 次。

1.3 实验分组 取处于对数生长期的Eca-109细胞，制成单细胞悬液，计数并确保细胞存活在95%以上。调整细胞密度为1×104mL-1，铺于96孔板，每孔200 μL，24 h后，按实验分组处理。细胞分为空白对照组、15 mmol/L 5-FU组和不同剂量(25、50、100 mg/L)的α-细辛醚组，空白对照组只加入等体积的培养液。每组设6个复孔。

1.4 MTT法检测细胞增殖能力 分组处理48 h后，每孔加入20 μL浓度为5 g/L的MTT，继续培养4 h,吸去上清，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min，酶标仪检测490 nm 处的OD值，表示细胞增殖能力。

1.5 细胞形态变化的观察 分组培养48 h后，观察细胞形态学变化，同时，运用DAPI 染色在荧光倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态变化。

1.6 Annexin V-PI法检测细胞凋亡情况 PBS洗涤细胞， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化2～3 min，转移至离心管中，加入培养液，吹打混匀后，1 000 r/min 4 ℃离心5 min，弃上清，PBS重悬细胞，取0.5 mL细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加0.5 mL Binding Buffer重悬细胞，加入1 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀后，避光4 ℃孵育 5～10 min，加入400 μL Binding Buffer，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 Western blot检测cytC、bax蛋白的表达 提取培养48 h的各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；取30 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭，加入兔抗人一抗(1:2 000)进行杂交，4 ℃反应过夜，充分漂洗后，加入HRP标记羊抗兔二抗(1:3 000)，室温振摇2 h，充分洗涤后，加入ECL超敏发光液，反应5 min后，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影，使用Quantity One分析条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.8 实时荧光定量PCR法检测cytC、bax mRNA的表达 采用Trizol法提取细胞总RNA，确定其纯度及完整性。引物序列如下：β-actin上游5’-CCGTCTTCCCCTCCATCG-3’， 下游5’-GTCCCAGTT GGTGACGATGC-3’，扩增片段大小155 bp ；cytC上游5’-TTGCACTTACACCGGTACTTAAGC-3’，下 游 5’-ACGTCCCCACTCTCTAAGTCCAA-3’，扩增片段大小62 bp；bax上游5’-CTGCGAACTAACAGGCAAGC-3’,下游5’-CTAGATATGGCGTCCAGCTG-3’，扩增片段大小286 bp。按照反转录试剂盒说明合成cDNA。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。PCR反应体系：总反应体积为10 μL, 其中5×Primer Script Buffer 2 μL，Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L) 0.5 μL，RNA(100 μg/L) 5 μL，无RNase dH2O 1.5 μL。以β-actin为内参，根据 2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。

1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0分析，各组细胞增殖能力、凋亡率、cytC和bax表达的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力和凋亡情况 与空白对照组比较， 5-FU和不同剂量的α-细辛醚均可抑制 Eca-109细胞增殖，促进其凋亡，结果见表1。

表1 各组细胞增殖能力和凋亡情况(n=3)

*：与空白对照组比较，P<0.05 。

2.2 各组细胞形态观察 空白对照组细胞核被染成均一的淡蓝色， 完整性良好， 未见明显的凋亡细胞。α-细辛醚处理后细胞出现体积缩小，细胞核皱缩、 染色加深等典型的凋亡形态特征；并且随着α-细辛醚浓度的增加，细胞总数明显减少，核固缩、核碎片增多。各组细胞形态见图 1。

A：空白对照组;B：5-FU组；C：25 mg/L α-细辛醚组；D：50 mg/L α-细辛醚组；E：100 mg/L α-细辛醚组。图1 各组细胞形态观察(×200)

2.3 各组细胞cytC和bax蛋白的表达 与空白对照组比较，其他各组cytC和bax蛋白表达显著升高。结果见图2、表2。

1：空白对照组；2：5-FU组；3：25 mg/L α-细辛醚组；4：50 mg/L α-细辛醚组；5：100 mg/L α-细辛醚组。图2 各组细胞cytC和bax蛋白的表达

表2 各组细胞cytC和bax蛋白的表达(n=3)

*：与空白对照组比较，P<0.05。

2.4 各组细胞cytC和bax mRNA的表达 与空白对照组比较，其他各组cytC和bax mRNA表达显著升高。结果见表3。

表3 各组细胞cytC和bax mRNA的表达(n=3)

*：与空白对照组比较，P<0.05。

3 讨论

食管癌等恶性肿瘤严重威胁人类健康和生命。近来研究[4-5]表明，肿瘤的发生和发展与细胞凋亡异常相关。肿瘤细胞多存在凋亡不足，因而诱导肿瘤细胞凋亡成为肿瘤治疗的新思路。

细胞凋亡调控的信号转导机制十分复杂，目前认为，至少有3条通路参与：线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路。其中，线粒体通路作为细胞能量代谢的“工厂”，在细胞凋亡过程中处于中心地位，又称内源性凋亡途径[6]。在氧化应激、DNA损伤、X射线、化疗药物等促凋亡信号作用下，MPTP不可逆性开放，导致线粒体跨膜电位消失，呼吸链解偶联，线粒体基质渗透压升高，内膜肿胀，位于线粒体膜间隙的cytC等凋亡因子释放于细胞质内，cytC在ATP/dATP存在的条件下，能与凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease-activating factor 1，Apaf 1)形成多聚复合体，通过 Apaf 1氨基端的caspase募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)募集胞质中的bax前体，从而使其自我剪切而活化，并启动caspase级联反应，激活下游的caspase-3和caspase-7，完成对其相应底物的切割，引起细胞凋亡[7-8]。在前期的研究中，作者发现细辛醚可激活线粒体通路，导致Smac因子释放。该研究结果进一步显示，α-细辛醚可导致Eca-109细胞中cytC表达上调，从而诱导细胞凋亡。

bax 是 Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白之一。Bcl-2家族蛋白相互作用，通过激活下游系列基因，发挥调节细胞凋亡的作用，控制着线粒体内膜和外膜的通透性，因此Bcl-2家族是线粒体凋亡途径的主要调控者[9]。正常情况下，bax主要分布于细胞质，在凋亡信号的作用下，bax从胞质进入线粒体得以活化，活化的bax与线粒体内膜的内膜腺苷转位因子(adenine nucleotide translocator,ANT)和外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)结合，导致MPTP开放，线粒体膜通透性破坏，致cytC等物质释放，促使细胞凋亡[10]；同时，bax还可通过 BH3 结构域识别并结合于线粒体膜上的Bcl-2蛋白，形成bax-Bcl-2二聚体，从而拮抗Bcl-2的抗凋亡作用[11]。陈志英等[12]应用免疫组化法检测58例结直肠癌中bax的表达， 并以20例结直肠黏膜炎症组织为对照，结果表明bax在结直肠癌中的表达明显低于炎症组织，提示bax低表达与结直肠癌等肿瘤相关。该研究结果显示，α-细辛醚可上调Eca-109细胞bax mRNA和蛋白的表达，促进cytC释放，诱导人食管癌细胞凋亡。然而bax上游的调控基因及机制有待进一步考证。

总之，α-细辛醚可通过上调cytC、bax表达，抑制Eca-109细胞增殖，促进其凋亡。

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(2016-09-01收稿 责任编辑李沛寰)

Expressions of cytochrome C and bax on Eca-109 cells inducing by α-asarone

ZHANGYan,HANQianqian,ZHUYanqin

SchoolofBasicMedicine,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046

α-asarone;cytochrome C;bax；Eca-109 cell

Aim: To observe the influence of α-asarone on esophageal carcinoma Eca-109 cells apoptosis and cytochrome c(cytC), bax expression, and explore its molecular mechanism.Methods: 5-FU and different dosages of α-asarone were used to intervene culture Eca-109 cellsinvitro. morphologic changes were viewed under an inverted fluorescence microscope after DAPI staining assay. Cell proliferation and apoptosis rate were measured by MTT and Annexin V-PI. The protein and mRNA expression levels of cytC and bax were detected by Western blot and real-time quantitative PCR.Results: Compared with blank group,cell proliferation rate decreased significantly, and cell apoptosis rate increased significantly in 5-FU and different dosages of α-asarone groups(P<0.05), the expression levels of cytC and bax protein and mRNA increased significantly in 5-FU different dosages of α-asarone groups(P<0.05).Conclusion: α-asarone could inhibit Eca-109 cells proliferation and induce cell apoptosis via up-regulating cytC and bax′s expression.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.003

*河南省基础与前沿技术研究项目 072300450030；河南省科学技术研究重点项目 13A310612；河南省教育厅高等学校重点科研项目 16A310021

R735.1