miR-132 在神经胶质瘤中表达及临床意义

武丽芳，杜剑峰

miR-132 在神经胶质瘤中表达及临床意义

武丽芳，杜剑峰

目的：探讨神经胶质瘤组织中微小 RNA-132（miR-132）的表达及临床意义。方法：采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）方法检测新鲜神经胶质瘤组织标本 135例及正常脑组织标本53 例中 miR-132 的表达，分析其与神经胶质瘤的临床病理特征关系、诊断价值及与预后的关系。结果：miR-132 在神经胶质瘤组织中的表达显著高于正常组织（P＜0.05）；miR-132 在神经胶质瘤组织高表达和低表达组在肿瘤切除程度、WHO 分级、KPS 评分方面差异均具有统计学意义（均 P＜0.05）；ROC 曲线分析 AUC=0.856（P＜0.001），灵敏性和特异性分别是 52.7%和 86.6%，Youden 指数为 0.465；miR-132 高表达和低表达组在总生存时间及无进展生存时间上的差异具有统计学意义（均P＜0.05）。结论：miR-132 在神经胶质瘤中高表达的，可能可作为神经胶质瘤的新型生物标记物和诊断靶标。

miR-132；神经胶质瘤；ROC 曲线；临床病理特征；生物标记物

神经胶质瘤是最常见的原发性恶性脑瘤 ，世 界 卫 生 组 织（World Health Organization，WHO）根据病理组织恶性程度将原发神经胶质瘤分为4个等级，1、2级是低等级胶质瘤，3、4 级是高等级胶质瘤[1]。高等级胶质瘤1年总体生存率为40%，5年生存率不足10%，因此迫切需要新的治疗方法和新型肿瘤标记物用于神经胶质瘤的诊断及治疗。

微小 RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一类小的、内源性的非编码 RNA，通过与mRNAs的3’端UTR互补结合从而负调控基因表达[2]。miRNAs通过靶向多个基因，对大量重要的生理和病理功能过程进行调控。异常miRNAs表达通常与各种不同恶性肿瘤的形成有关，同时失调的miRNAs具有癌基因或抑癌基因的特性[2]。作为 miRNAs家族中的一员，miR-132在炎症、血管新生及神经发育过程中具有重要的作用[3]。miR-132 的失调与非小细胞肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌的发生发展紧密相关[4-6]。但 miR-132 在神经胶质瘤中的表达和临床意义还未见相关报道，因此，本文旨在研究神经胶质瘤中 miR-132 的表达、临床病理以及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 收集 2010 年 3 月至 2012 年3月我院确诊的神经胶质瘤组织标本135例为胶质瘤组，患者年龄28～74岁，平均年龄（47.7±7.8）岁；根据 WHO 分级，1 级纤维性星形细胞瘤 26 例，2 级弥漫性星形细胞瘤 28例，3级间变星形细胞瘤39例，4级恶性胶质瘤42例；所有患者手术前均未接受化疗或放疗；所有患者都签署同意书，并通过电话或者家访的形式定期随访48月，记录患者的生存状况和疾病进展情况。同期脑损伤或脑出血患者53例，行颅内减压术时获取正常脑组织为对照组。所有标本取完后立即保存于液氮中备用。

1.1.2 试 剂 和 仪 器 RNA 提 取 试 剂 Trizol（Invitrogen, Carlsbad,CA,USA），NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer（NanoDrop Technologies,Houston,TX,USA），Prime-Script逆 转 录 -PCR 试 剂 盒（NCode ™ SYBR®Green miRNA quantitative real-time PCR）购 自 Invitrogen 公司，Premix EX Taq DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司，ABl7300荧光定量PCR仪购自ABI公司。

1.2 方法

①RNA提取：组织破碎仪破碎组织后分别提取2组的总 mRNA，具体操作参考 Trizol®RNA 提取试剂盒说明；Nanodrop 测定总 mRNA 的含量和浓度，所有RNA 测量吸光度（A）值，保证 RNA 的完整性（A260/ A280＞2.0）。②cDNA 逆转录：总 mRNA 按照 Invitrogen 公司逆转录试剂盒操作说明逆转录成 miR-132 及内参 U6B 的 cDNA。③real-time PCR：用 SYBR Green试剂盒进行 real-time PCR 扩增，反应体系：1 µL cDNA (500 ng/20µL)，0.6 µL 引物 (10 pmol/L)，9 µL 2×SYBR Green PCR Master Mix，无 RNA 酶水 8.4 µL。 反应 条件：95 ℃ 2 min 预热，95 ℃ 15 s 变性，55 ℃ 30 s 退火，68 ℃ 30 s延伸，40 个循环。引物序列为 miR-132：正向引物 5’-TGGATCCCCCCCAGTCCCCGTCCCTCAG-3’，反向引物 5’-TGAATTCGGATACCTTGGCCGGGAGGAC-3’；U6B：正向引物 5’-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’，反向引物 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 miR-132 在神经胶质瘤中显著性的高表达

qRT-PCR 定量分析结果显示，神经胶质瘤中 miR-132 的相对表达量为（4.448±1.857），显著高于正常组的（1.936±0.543）（P＜0.001），见图 1。

图1 qRT-PCR 定量分析 miR-132 在神经胶质瘤和正常脑组织中的表达差异

2.2 miR-132 表达与神经胶质瘤患者临床病理特征的关系

根据患者肿瘤 miR-132 表达高低分为 2 亚组，表达量高于平均值的为高表达亚组68例，低于平均值的为低表达亚组 67 例。对 miR-132表达与患者临床病理特征关系进行分析比较，发现2亚组的年龄、性别及照射模式差异无统计学意义；而切除程度、WHO分级、KPS评分差异有统计学意义，见表1。

2.3 miR-132 作为神经胶质瘤潜在生物标志物的诊断价值

用 ROC 曲线评价 miR-132作为神经胶质瘤中潜在的生物标志物的诊断价值，见图 2。其中 cut-off值是7.361；ROC 曲 线 下 面 积 AUC 为 0.856（95%CI，0.7141～0.9112；P＜0.001）；灵 敏 性 和 特 异 性 分 别 是52.7%和 86.6%；Youden 指数为 0.465。此 ROC 曲线提示miR-132在神经胶质瘤中具有诊断价值。

2.4 miR-132 表达对患者生存关系影响

miR-132 高表达亚组患者的总体生存时间为 27 个月（95%CI为 23.2～31.6），无进展生存时间为 18 个月（95%CI为 16.7～21.8）；miR-132 低表达亚组总体生存时间为 43 个月（95%CI为 35.7～46.3），无进展生存时间为 47 个月（95%CI为 36.7～49.2）。对 2 亚组患者采用 Kaplan-Meier法进行生存数据假设检验比较的 logrank检验表明，miR-132 的表达与胶质瘤患者总生存时间（χ2=8.517，P=0.0072＜0.01）及无进展生存时间（χ2= 6.554，P=0.0084＜0.01）上的差异具有统计学意义，故可认为 2 亚组生存曲线不同。提示 miR-132 高表达与神经胶质瘤患者不良预后紧密相关，见图3。

表1 神经胶质瘤 miR-132 表达量与患者临床病理特征的关系

图2 神经胶质瘤患者的 miR-132 ROC 曲线

3 讨论

由于神经胶质瘤早期阶段无症状进展[7]，患者的预后通常不好。因此有必要理解胶质瘤发生进展的机制，神经胶质瘤预后因子的鉴定对于预测患者生存和确定最优的治疗策略有重要的意义。

miRNAs被预测可调控人基因组中 30%的编码蛋白的基因，是基因表达的重要调节因子[8]。miR-132 是高度保守的miRNA，从人类17号染色体内含子上转录而来，通过转录因子 cAMP 响应原件结合蛋白[9]。关于miR-132 调控及生物学功能的报道大部分来自于神经元的研究[10,11]，在炎症、细胞转化及肿瘤发生等生理过程中的功能也有报道[3]。最近研究表明，miR-132 失调与非小细胞肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌的发生进展相关；miR-132的作用机理也在各种肿瘤中被广泛研究。Park 等[12]发现 miR-132 和 miR-212过表达可导致胰腺癌细胞中磷酸化Rb蛋白表达下调及转录因子E2F靶基因表达上调，导致胰腺癌细胞增殖增加。Zhang 等[13]发现 miR-132 过表达可下调 AKT磷酸化及 Cyclin D1 蛋白表达，但对 ERK 和 JNK 表达和磷酸化水平没有影响，表明 miR-132 通过抑制 AKT信号通路，表现出肿瘤抑制功能。You 等[14]发现 miR-132可通过靶向ZEB2调控上皮间质细胞转化（EMT），显著性抑制肺癌的迁移和浸润。但 miR-132 在胶质瘤中表达的临床意义还没有相关报道

本研究结果显示，miR-132 在胶质瘤组织中mRNA表达水平呈显著增高，与 Lages等[15]研究结果基本一致。提示 miR-132 在胶质瘤的发生发展中可能发挥非常重要的作用。本研究将脑损伤或脑出血患者行颅内减压术时获取的组织作为对照组，而并未对脑损伤或脑出血对 miR-132 的表达干扰进行排除，这也可能对实验结果产生一定影响，后续将对 miR-132 在脑损伤或脑出血患者中的表达和临床意义进行研究。

通过对 miR-132 表达与临床病理特征的相关性分析发现，miR-132 与 KPS 评分、肿瘤切除程度、WHO 分级显著相关。通过 Kaplan-Meier生存分析发现具有miR-132 高表达患者的总体生存时间 OS 及无进展生存时间 PFS 显著降低，提示 miR-132 与神经胶质瘤的不良预后紧密相关。ROC 曲线分析表明，miR-132 可作为临床诊断的生物标志物，具有一定临床诊断价值。

综上所述，本研究结果首次发现 miR-132 在神经胶质瘤中高表达，可能可作为预测神经胶质瘤预后和诊断的生物标志物。这一发现具有重要的提示意义，下一步拟进行大样本的研究以进一步确认 miR-132 在神经胶质瘤中的预后作用。

图3 miR-132 表达量与患者总体生存率和无进展生存率的关系

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（本文编辑：唐颖馨）

The Expression and Clinical Significance of miR-132 in Glioma

WU Li-fang,DU Jian-feng.
Department of Neurology,Affiliated Hospital of YanAn University,Shan Xi 716000,China

Objective:To investigate the expression and clinical significance of microRNA(miR-132)in patients with glioma.Methods:One hundred thirty-five cases with glioma(glioma group)and 53 cases of normal brain tissues(control group)were collected.Real-time quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to detect the miR-132 expression in 2 groups.The clinic pathological characteristics of miR-132 expression were further analyzed.A receiver operating characteristic(ROC)curve was constructed to determine the diagnostic value of miR-132.Results:miR-132 expression was significantly up-regulated in the glioma group compared with that in the normal group(P＜0.05).There was significant differences between KPS score,extent of resection and WHO grade in terms of miR-132 expression(P＜0.05).The area under the ROC curve was 0.856 (P＜0.001),the sensitivity was 52.7%,the specificity was 86.6%and the index of Youden was 0.465.The overall survival time and progression free survival in miR-132 high expression and low expression sub-groups were statistically significant(P＜0.01).Conclusion:miR-132 may be involved in carcinogenesis of glioma,which may be a new biomarker for diagnosis and treatment.

miR-132;glioma;ROC curve;clinicopathological;biomarker

R741；R739.41

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.03.011

延安大学附属医院神经内科陕西 716000

2016-12 -28

武丽芳wulifang1980125@ 126.com