CXCL12/CXCR4生物轴对慢性病毒性心肌炎小鼠心肌纤维化的影响

郭春艳，韩波，梁皓，张晓静 ，汪翼

(1山东大学附属省立医院，济南250021；2济南市妇幼保健院)

CXCL12/CXCR4生物轴对慢性病毒性心肌炎小鼠心肌纤维化的影响

郭春艳1，韩波1，梁皓1，张晓静2，汪翼1

(1山东大学附属省立医院，济南250021；2济南市妇幼保健院)

目的 探讨CXCL12/CXCR4生物轴与慢性病毒性心肌炎(CVMC)心肌纤维化的关系。方法 取4周龄BALB/C健康雄性小鼠30只，随机分为对照组(n=10)和CVMC组(n=20)。CVMC组以柯萨奇病毒B3株1×109/mL腹腔重复增量感染(第0天、14天、28天剂量分别为0.20、0.25、0.30 mL)建立CVMC模型；对照组同期腹腔注射等体积生理盐水。第42天麻醉后行心脏超声检查心率、左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、主动脉血流峰值速度，并计算短轴缩短率和射血分数。检查后断髓处死小鼠，取心脏组织进行心肌组织病理学检查及胶原容积测定，计算心肌组织中的胶原容积积分(CVF)。采用Western blotting检测心肌组织中CXCL12、CXCR4蛋白表达，RT-PCR检测心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达。结果 与对照组比较，CVMC组小鼠心肌组织CVF增大，Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的含量增加，CXCL12、CXCR4蛋白表达增多，差异均有统计学意义(P均<0.05)。心肌组织CVF与CXCL12 、CXCR4蛋白表达均呈正相关(r分别为0.79、0.60，P均<0.05)。结论 CXCL12/CXCR4生物轴与CVMC心肌纤维化的发生密切相关。

病毒性心肌炎，慢性；CXCL12/CXCR4生物轴；心肌纤维化；小鼠

病毒性心肌炎是心血管系统常见疾病，经积极治疗大多可痊愈；但少数患者可迁延为慢性病毒性心肌炎(CVMC)，甚至发展为扩张型心肌病而预后不良。心肌间质纤维化是CVMC的病理改变特征[1]。最新研究发现，CXCL12/CXCR4生物轴能促进纤维细胞增殖、肌成纤维细胞形成、细胞外基质沉积，从而加速组织纤维化发病进程。为进一步了解CVMC心肌纤维化的发生机制，2014年4月～2016年4月，我们对CXCL12/CXCR4生物轴与CVMC心肌纤维化之间的相关性进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 病毒：柯萨奇病毒B3株(CVB3)Nancy标准株购自山东省医学科学院基础研究所微生物室。在Hela细胞上传代，冻融3次，并测得半数细胞感染率为1×109/mL。动物：4周龄BALB/C健康雄性小鼠30只，体质量为15～20 g，由山东大学动物实验中心提供。试剂：苦味酸-天狼猩红染液购自北京雷根生物技术有限公司；兔抗小鼠CXCL12、CXCR4多克隆抗体购自Abcam公司；封闭用正常山羊血清工作液、山羊抗兔生物素化二抗工作液、辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液均购自北京中山金桥生物技术有限公司；浓缩型DAB试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司；BCA-100蛋白质定量测定试剂盒及RIPA蛋白裂解液购自Millipore公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG购自Thermo公司；ECL显影试剂盒购自美国Santa Cruz公司；MMLVRT-PCR扩增试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 动物模型制备及相应处理 30只小鼠随机分为对照组(n=10)和CVMC组(n=20)。CVMC组分别于第0、14、28天腹腔接种1×109/mL的 CVB3 0.2、0.25、0.3 mL共3次[2，3]，对照组小鼠同期腹腔注射等体积生理盐水。第42天时将两组小鼠腹腔注射3%水合氯醛(0.01～0.015mL/g)麻醉后应用PHILIPS 7500彩色多普勒超声显像仪检查心率(HR)、左室舒张末期内径(LVDD)、左室收缩末期内径(LVSD)、主动脉血流峰值速度(Vp)，并计算短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)。检查后断髓处死，取心脏，滤纸吸干，沿左室长轴分为两部分，一部分放入10%中性甲醛固定，待做HE、苦味酸天狼猩红染色；另一部分放入-80 ℃冻存，以备Western blotting分析及RT-PCR检查。

1.3 心肌组织病理学检查及胶原容积测定 小鼠心肌组织标本的石蜡切片分别以HE常规染色及苦味酸天狼猩红胶原染色,确认心脏病理变化以及心肌纤维化改变。普通显微镜下胶原组织呈红色，心肌组织呈黄色。采用Leica照相系统拍照，每张切片随机选取5个视野(不包括血管)，用Qwin图像分析系统计算每个视野中胶原组织所占百分比，最后取均数即为胶原容积积分(CVF)，以反映心肌间质纤维化程度。

1.4 心肌组织中CXCL12、CXCR4蛋白表达 采用Western blotting法，严格按试剂盒说明操作。将心肌组织放入EP管打进预冷的含有1‰PMSF的生理盐水，用剪刀剪碎，生理盐水清洗。加裂解液、超声裂解并4 ℃离心(20 000r/min)30 min，吸取上清液测定蛋白浓度，各泳道加样量为60 μg蛋白体积+1/3蛋白体积的4×Loading buffer。8% SDS聚丙烯酰胺凝胶100 V电泳90 min，将分离的蛋白质转膜60 min至硝酸纤维素膜。加入兔抗小鼠CXCL12、CXCR4多克隆抗体，4 ℃过夜。二抗室温孵育60 min后，TBST洗膜3次进行ECL化学发光、X线曝光及显影、定影，应用Alphalmager TM 2200凝胶成像仪进行凝胶扫描和分析，以目的片段/内参照GAPDH片段的条带光密度比值作半定量比较。

1.5 心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达检测 采用RT-PCR法。①RNA提取：取50～100 mg心脏组织剪碎后加Trizol于匀浆器中匀浆，异丙醇沉淀，乙醇洗涤，最后溶于焦碳酸二乙酯处理的水中。分光光度计测其浓度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。②RT反应：取5 μg总RNA按照MMLV说明书逆转录为cDNA。③PCR反应：以β-actin为内参照，引物均由济南博亚生物科技有限公司合成。PCR反应条件为：预变性95 ℃ 5 min，变性94 ℃ 60 s，退火55 ℃ 60 s，延伸72 ℃ 60 s，循环33次。④PCR产物定量:PCR产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳分离，应用Alphalmager TM 2200凝胶成像仪进行凝胶扫描和分析，以目的片段/内参照β-actin片段的条带光密度比值作半定量比较。

2 结果

2.1 两组心脏超声检查指标 至第42天时，CVMC组小鼠死亡7只，存活13只。与对照组比较，CVMC组LVDD、LVSD增大, Vp、FS、EF降低，HR增快(P均<0.05)。见表1。

2.2 两组心肌组织病理变化及胶原容积 HE染色：对照组小鼠心肌细胞形态正常，肌原纤维排列致密、整齐，间质成纤维细胞数量、形态正常，无明显病理改变；而CVMC组小鼠心肌纤维排列疏松，间质成纤维细胞明显增生。苦味酸天狼猩红染色：对照组小鼠心肌细胞间隙可见少量红色纤细的胶原，而CVMC组心肌胶原明显增生、变粗，并且将心肌细胞分割呈网筛状。CVMC组CVF为(13.95±1.08)%，对照组为(6.52±1.31)%，CVMC组CVF较对照组明显升高(P<0.05)。

表1 两组心脏超声检查指标比较

注：与对照组相比，▲P<0.05。

2.3 两组心肌组织中CXCL12、CXCR4蛋白表达 两组心肌中均可检测到CXCL12、CXCR4蛋白表达，CVMC组表达较对照组明显增强。对照组CXCL12与GAPDH吸光度比值为0.33±0.06，CVMC组为0.90±0.09，两者相比有统计学差异(P<0.05)；对照组CXCR4与GAPDH吸光度比值为0.11±0.03，CVMC组为0.42±0.07，两者相比有统计学差异(P<0.05)。

2.4 两组心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达 CVMC组小鼠心肌中Ⅰ型胶原及Ⅲ型原的含量较对照组明显增加，但Ⅰ型胶原增加更为突出，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值亦较对照组明显增大(P均<0.05)。见表2。

表2 两组心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原水平比较

注：与对照组相比，◆P<0.05。

2.5 心肌组织中CVF与CXCL12、CXCR4蛋白表达相关性 心肌组织中CVF与CXCL12、CXCR4蛋白表达均呈正相关(r分别为0.79、0.60，P均<0.05)，CXCL12/CXCR4生物轴可促进CVMC心肌纤维的增生。

3 讨论

CVMC的病程多在1年以上，临床表现为心功能下降及进行性心脏扩大，病理特征为心肌间质纤维化[1], 主要表现为心肌Ⅰ型、Ⅲ型胶原的增生及其比例的失调，因此阻逆胶原增生，抑制心肌纤维化是防止CVMC向扩张型心肌病转化的关键。

CVB3株是引起CVMC最常见的病毒[4], CVMC的发生、发展依赖于病毒的持续存在[5]。小鼠心肌炎的分期为第0～4天为急性期，第4～14天为亚急性期，第14～90天为慢性期[6]。本研究通过以CVB3株重复增量感染小鼠，第42天时行小鼠心脏B超检查了解心功能及心脏大小，并行心肌组织HE染色及胶原特异性染色，发现感染CVMC组小鼠LVDD、LVSD较对照组小鼠明显增大，但Vp、FS及EF等均较对照组显著降低。CVMC组HE染色显示心肌纤维排列疏松，间质成纤维细胞明显增生，可见少许炎性细胞浸润，苦味酸天狼猩红染色发现其心肌CVF也较对照组小鼠显著增加。以上结果说明第42天时小鼠已具备CVMC的临床及病理特征，证明此时CVMC模型制备成功。

心肌与非心肌细胞通过结缔组织和细胞外基质(ECM)相互连接，ECM成分包括胶原、蛋白多糖、糖蛋白、肽生长因子及蛋白酶。心肌间质的主要成分是由心肌间隙中成纤维母细胞产生和分泌的胶原纤维组成，对维持心脏正常的形态和功能起重要作用[7]。心肌胶原纤维相互交织，构成一个多层次、多方位、复杂的三维空间结构，心肌细胞被包围、固定和活动在这个网络之中[8]。有报道心肌ECM中胶原的数量、组成和结构的变化参与心脏重构过程[9]，通过调节细ECM的特性和数量，非心肌细胞在决定心肌对病理刺激的反应方面(如血流动力学负荷过重)起重要作用。心脏间质胶原分为Ⅰ、Ⅲ 、Ⅳ 、Ⅴ和Ⅵ 型等，其中90%由Ⅰ型和Ⅲ 型胶原构成。Ⅰ型抗张强度大，伸展及回弹性小，主要聚合粗纤维；Ⅲ型抗张强度小，具有较大的伸展和回弹性，主要聚合细纤维。CVMC时Ⅰ型、Ⅲ型胶原大量增生[10]。本研究也发现CVMC小鼠心肌组织Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达较对照组小鼠明显增强，但其中Ⅰ型胶原增生更加明显，从而导致Ⅰ/Ⅲ型胶原比例增大。因Ⅰ型胶原抗张强度大，伸展及回弹性小，从而使小鼠心肌顺应性下降，僵硬度增加。胶原组织紧绕心肌细胞，心肌细胞可能因慢性缺氧而死亡或触发细胞凋亡，间质毛细血管床减少，进而导致心脏舒缩功能障碍。

纤维化形成是一个缓慢的动态过程，涉及到细胞、细胞因子和ECM等多种因素、多环节间相互作用和相互调节的复杂过程，最终结局是大量ECM沉积。目前普遍认为引起心肌胶原重构的主要因素是基质金属蛋白酶系统失衡以及一些内分泌激素和细胞因子异常激活。但最新研究发现，趋化因子CXCL12参与了表达CXCR4成纤维细胞的活化、增殖、迁移及细胞外基质的分泌等功能，提示CXCL12/CXCR4生物轴在组织纤维化发病进程中发挥重要作用。CXCL12即基质细胞衍生因子1，是骨髓基质细胞及成骨细胞所产生的CXC类趋化蛋白，其基因位于10号染色体长臂[11],是CXCR4的唯一配体。CXCR4是由352个氨基酸组成的高度保守的具有7个跨膜结构域的GTP-蛋白藕联的跨膜受体，是纤维细胞的主要趋化因子受体。CXCL12、CXCR4广泛表达于多种细胞及组织，通过作用于趋化因子受体参与多种生理及病理过程，对病原因子的清除、炎症反应、过敏性疾病、免疫系统自身稳定、心脏血管发育、中枢神经系统网络发育及肿瘤生长与转移均起着至关重要的作用[12]。但近年研究发现[13]，成纤维细胞在肺部的形成与聚集也与趋化因子CXCL12及其受体CXCR4的表达有关，通过调节CXCR4的表达可以减轻甚至抑制肺纤维化的发生。Phillips等[14]研究发现在博来霉素致小鼠肺纤维化的模型及人的肺纤维化病灶中CXCL12/CXCR4生物轴在纤维细胞向肌成纤维细胞转化的过程中发挥了关键作用。Mehrad等[13]报道在博来霉素致小鼠肺纤维化的模型中应用抗CXCL12抗体阻断CXCL12的表达后，小鼠肺中表达CXCR4的细胞明显减少，且胶原蛋白的沉积和肺纤维化的程度也明显减轻。近年来还发现CXCL12/CXCR4生物轴与前列腺的组织纤维化也密切相关[15，16]。本实验发现CVMC小鼠心肌组织中CXCL12、CXCR4蛋白表达均较对照组显著增高，并且蛋白含量与心肌组织中CVF呈正相关，此结果提示CXCL12/CXCR4生物轴可促进CVMC心肌纤维的增生，与CVMC心肌纤维化的发生有关。

总之，本研究发现CVMC的病理特征即为心肌间质纤维化，且主要表现为Ⅰ、Ⅲ型胶原的增生及其比例的失调。CXCL12/CXCR4生物轴可促进心肌纤维化的发生、发展。

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Influence of CXCL12/CXCR4 biological axis on myocardial fibrosis in mice with chronic viral myocarditis

GUOChunyan1,HANBo,LIANGHao,ZHANGXiaojing,WANGYi

(1ProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Jinan250021,China)

Objective To study the relationship between the CXCL12/CXCR4 biological axis and myocardial fibrosis in chronic viral myocarditis (CVMC).Methods Thirty 4-week-old Balb/c mice were randomly divided into the control group (n=10) and CVMC group (n=20). The mice in the CVMC group were infected with Coxsachie virus B3 (CVB3, 1×109/mL) to establish CVMC models on day 0, 14 and 28 with the volume of 0.20, 0.25 and 0.30 mL, respectively. The mice in the control group

the equal volume normal of saline. After anesthesia, the heart rate (HR), left ventricular end-diastolic internal diameter (LVDD), left ventricular end-systolic internal diameter (LVSD), and peak velocity of aorta (Vp) at least 3 consecutive cardiac cycles were measured by echocardiography on day 42. Meanwhile, the ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS) were calculated. Mice were killed after echocardiographic analysis.Then we counted the ratio of heart weight to body weight (HW/BW). Heart slides were stained with collagen specific picrosirius red staining or HE staining. The collagen volume fraction (CVF) was calculated. The protein expression of CXCL12 and CXCR4 was determined by Western blotting. The mRNA expression of type I collagen and type Ⅲ collagen was determined by RT-PCR.Results Compared with the control group, the CVF, the mRNA expression of type I collagen and type Ⅲ collagen and the protein expression of CXCL12 and CXCR4 significantly increased in the CVMC group (allP<0.05). The CVF was positively correlated with CXCL12 and CXCR4 protein expression in the CVMC group (r=0.79, 0.60, allP<0.05).Conclusion CXCL12/CXCR4 biological axis is closely related to CVMC myocardial fibrosis.

viral myocarditis, chronic; CXCL12/CXCR4 biological axis; myocardial fibrosis; mice

山东省自然基金面上项目(ZR2012HM073)。

郭春艳(1973-)，女，副主任医师，研究方向为小儿急性及慢性病毒性心肌炎的诊治。E-mail：guochunyan0531@163.com

汪翼(1945-)，女，教授，主要从事小儿心肌炎、心肌病以及肥胖症、糖尿病的早期干预研究。E-mail：sdjnwangy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.007

R542.2

A

1002-266X(2017)17-0021-04

2017-02-13)