GeneXpert MTB/RIF在脊柱结核诊断中的应用

周正，王晓蕾，陈海燕，马源慧，周西清，景辉，赵跃然

(1济南大学·山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250013；2山东省胸科医院；3山东省医学科学院)

GeneXpert MTB/RIF在脊柱结核诊断中的应用

周正1,2，王晓蕾2，陈海燕2，马源慧2，周西清2，景辉2，赵跃然3

(1济南大学·山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250013；2山东省胸科医院；3山东省医学科学院)

目的 探讨GeneXpert MTB/RIF在脊柱结核诊断中的应用价值。方法 采用GeneXpert MTB/RIF对临床及病理检查确诊的72例脊柱结核患者和20例非脊柱结核患者的脊柱组织标本进行检测，计算其诊断脊柱结核的敏感性、特异性、阴性预测值、阳性预测值，并与MGIT960液体培养、抗酸涂片染色法进行比较；评价GeneXpert MTB/RIF检出利福平(RIF)耐药性的效能。结果 GeneXpert MTB/RIF检测诊断脊柱结核的敏感性为76.38%(55/72)、特异性为95.00%(19/20)，MGIT 960液体培养诊断诊断脊柱结核的敏感性为54.60%(39/72)、特异性为90.00 %(18/20)，抗酸涂片染色法诊断诊断脊柱结核的敏感性为27.77 %(20/72)、特异性为100%(20/20)。GeneXpert MTB/RIF检测诊断脊柱结核的敏感性高于MGIT 960液体培养和抗酸涂片染色法(P均<0.05)。结论 GeneXpert MTB/RIF可辅助诊断脊柱结核能显著提高脊柱结核的检出率。

脊柱结核；脊柱组织标本评价系统；结核分枝杆菌；利福平；MTB/RIF检测系统

中国是全球结核病高发病率国家之一，结核病患者数量仅次于印度[1]。脊柱结核是结核病的重要类型之一，占结核病患者的1%～5%[2]。其中，脊柱结核占骨结核的50%[3]。结核分枝杆菌(MTB)培养和抗酸杆菌染色法是传统结核病实验室诊断的金标准。然而，传统试验存在诸多弊端，如抗酸染色法阳性率偏低，结核培养周期较长，需3～8周，且对活菌的要求高。GeneXpert MTB/RIF作为一种快速、有效的分子诊断手段，可在2 h内直接从痰液标本中检测MTB和利福平(RIF)耐药性，其敏感性为67%～98%，特异性为98%[4,5]。本研究采用术后脊柱病灶组织标本，评价GeneXpert MTB/RIF在脊柱结核中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年1～12月山东省胸科医院收治的经临床诊断和病理检查确诊的脊柱结核患者72例，经影像学检查明确诊断，排除既往有结核感染的患者。其中男42例、女30例，年龄11～77岁、平均39.76岁，颈椎结核2例、胸椎结核22例、腰椎结核45例、骶椎结核3例，症状为咳嗽33例、咳痰23例、发热15例、咯血8例、胸痛11例、血液传播2例、继发性肺结核19例，经液体药敏法检测RIF耐药38例。选择同期经临床诊断和病理检查确诊的非结核患者20例，男11例、女9例，年龄22～45岁、平均37.89岁，椎间盘突出症11例、其他非结核疾病9例。两组均经手术治疗，术中获取脊椎病灶组织。

1.2 检测方法 根据患者病灶不同部位选取疑似结核病灶组织(脓液、干酪样组织、肉芽组织等)，将所获取的脊椎病灶组织进行充分粉碎研磨，加入氢氧化钠、磷酸盐缓冲液震荡离心，离心后的沉淀物分成3份待用，分别采用GeneXpert MTB/RIF、MGIT 960液体培养和药物敏感试验、抗酸涂片染色法进行检测。GeneXpert MTB/RIF检测：取沉淀物样本1 mL加入GeneXpert MTB/RIF样本前处理液2 mL，置于涡旋振荡器上混匀孵育15 min，取处理液加入反应盒后置于GeneXpert检测模块中，2 h后判读结果。结果判读：根据GeneXpert MTB/RIF探针的循环阈值(Ct值)，当内对照探针Ct值≤38为阳性。MGIT960液体培养和药物敏感试验：取沉淀物0.5 mL置于添加营养剂和杂菌抑制剂的MGIT960液体培养管中，放于MGIT 960培养仪中，监测管中氧气浓度，当氧气被消耗时，管底部的荧光显示剂在特定光源下激发出荧光，仪器通过数据处理得出阳性结果。对阳性样本进行RIF(1 μg/mL)药敏试验。抗酸涂片染色法：按照《结核病诊断实验室检验规程》中的要求进行标准化操作，当涂片结果≥1+(3～9条抗酸杆菌/100个视野)时，该涂片结果为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。以临床诊断及病理学检查为金标准计算各类检查方法诊断脊柱结核的敏感性、特异性、阴性预测值、阳性预测值及其95%置信区间。以液体药敏结果为金标准，评价GeneXpert MTB/RIF检出MTB及RIF耐药性的准确性。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GeneXpert MTB/RIF对脊柱结核的诊断效能 脊柱结核患者72例，GeneXpert MTB/RIF 检测MTB阳性55例、阴性17例，MGIT 960液体培养MTB阳性39例、阴性33例，抗酸涂片染色法MTB阳性20例、阴性52例。非结核患者20例，GeneXpert MTB/RIF 检测MTB阳性1例、阴性19例， MGIT 960液体培养MTB阳性2例、阴性18例，抗酸涂片染色法MTB阳性0例、阴性20例。三种检测方法对脊柱结核的诊断效能见表1。

表1 三种检测方法诊断脊柱结核的效能比较(%)

注：与MGIT960液体培养、抗酸涂片染色法比较，*P<0.05。

2.2 GeneXpert MTB/RIF对RIF耐药性的诊断价值 GeneXpert MTB/RIF对38例RIF耐药患者进行检测，检出RIF耐药23例。GeneXpert MTB/RIF对RIF耐药的敏感性为81.81%(18/22)，特异性为68.75%(11/16)。

3 讨论

近年来，我国脊柱结核患者日趋增多，并且耐多药的患者比例较高，约占22%[6]。传统的结核培养和抗酸染色涂片方法敏感性较低，常误诊[7]。WHO对结核病控制的重点是快速准确的诊断结核病尤其是提高耐多药结核的诊断能力。在结核病的分子诊断技术中，检测MTB的DNA可提高试验的有效性和准确性[8]。GeneXpert MTB/RIF以半巢式实时定量PCR为基础，检测MTB中rpoB基因，检测周期为2 h左右，并且可以检测RIF的耐药性。其在痰标本中检测结核病以及RIF耐药性的敏感性和特异性较高，成为WHO推荐的检测结核病的方法[9]。本研究以临床诊断和病理检查为金标准，使用的标本类型为脊柱结核病灶组织，比较GeneXpert MTB/RIF、MGIT960液体培养、抗酸涂片染色法三种方法对检测脊柱结核的效能。结果显示，GeneXpert MTB/RIF的敏感性远优于MGIT960液体培养、抗酸涂片染色法。Sun等[10]报道, GeneXpert MTB/RIF结果敏感性为80%，与本研究的76.38%相符，远高于结核杆菌固体和液体培养。本研究利用GeneXpert MTB/RIF分别与MGIT960液体培养、抗酸涂片染色法合并诊断脊柱结核，取得较好研究结果。其中，单独使用抗酸涂片诊断结核病的敏感性仅为27.77%，但与GeneXpert MTB/RIF合并后诊断的敏感性提升至51.85%，使用GeneXpert MTB/RIF联合抗酸涂片诊断能显著的降低了抗酸涂片的假阴性率。使用GeneXpert MTB/RIF联合抗酸涂片染色法可以在2 h内检测出MTB和RIF耐药性的结果，大大缩短诊断结核病的TAT时间[11,12]。本研究中在确诊脊柱结核患者中仍有17例标本的GeneXpert MTB/RIF结果显示阴性，此假阴性出现的原因可能为脊柱结核患者在术前已经使用大量的抗结核药物，并且手术后取得的标本被其他菌污染，干扰仪器的检测。

李力韬等[13]用GeneXpert MTB/RIF试验检测脊柱结核患者的敏感性和特异性均达到98%以上，明显高于本实验，与以下原因有关：①李力韬等研究中使用结核培养阳性的标本进行GeneXpert MTB/RIF试验，而本实验直接使用临床标本，未使用结核培养阳性标本菌株。②本实验样本量较少，并且病例中有儿童病例，有国外文献报道，GeneXpert MTB/RIF 试验检测儿童结核患者时，其敏感性和特异性明显低于成人[14]。③Arman等[15]试验结果为重复试验两次以上后记录的最后检测结果，而本实验仅检测一次。因此，GeneXpert MTB/RIF 检测次数的增加会在一定程度上可以加大其检测MTB的敏感性和特异性。

本研究以液体药敏结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF检测RIF的敏感性为81.81%，此结果与国外结果基本一致。然而特异性为68.75%，有5例标本未能检测出耐药基因的突变，原因可能为标本类型为术后组织标本，标本类型差异较大，组织标本含菌量较低，粉碎组织不彻底，并且其他组织杂质较多，标本的采集及运输中存在污染，从而影响GeneXpert MTB/RIF仪器中DNA的扩增。

本研究显示，GeneXpert MTB/RIF是一种快速、准确诊断脊柱结核及RIF耐药性的方法。由于样本量较少，本文仅就GeneXpert MTB/RIF对脊柱结核的诊断价值进行了总体研究，未对颈椎、胸椎、腰椎、骶椎结核的诊断进一步分析。因此，验证GeneXpert MTB/RIF对脊柱不同部位结核的早期诊断意义将是未来的研究方向。

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赵跃然(E-mail：yrzhao@sdu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.032

R529.2

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1002-266X(2017)17-0090-03

2017-02-24)