慢性高原病大鼠肝组织中扭转原肠胚形成同系物1、铁调素表达观察

刘玉洁，耿惠

(1淄博矿业集团集团中心医院，山东淄博255120；2青海大学附属医院)

·基础研究·

慢性高原病大鼠肝组织中扭转原肠胚形成同系物1、铁调素表达观察

刘玉洁1，耿惠2

(1淄博矿业集团集团中心医院，山东淄博255120；2青海大学附属医院)

目的 观察慢性高原病(CMS)大鼠肝组织中扭转原肠胚形成同系物1(TWSG1)、铁调素的表达变化，并探讨其意义。方法 50只雄性健康大鼠由西安运至西宁，随机分成6组，即低氧1组、低氧2组、CMS组、常氧1组、常氧2组、常氧3组。常氧1、2、3组分别在西宁(海拔2 260 m)常规饲养7、15、30 d。低氧1、2组和CMS组放入低压氧仓模拟海拔5 000 m环境，分别饲养7、15、30 d。CMS组成功制作CMS模型。采用qRT-PCR法检测肝组织中的铁调素、TWSG1 mRNA；采用免疫组化法检测肝组织中的TWSG1蛋白。结果 低氧2组、CMS组肝组织中铁调素mRNA相对表达量分别低于常氧2、3组，CMS组低于低氧1组(P均<0.05)。低氧1组、低氧2组、CMS组肝组织中TWSG1 mRNA相对表达量分别高于常氧1、2、3组，低氧1组、低氧2组、CMS组TWSG1 mRNA相对表达量依次增高(P均<0.05)。低氧1组、低氧2组、CMS组TWSG1蛋白表达阳性分别为8、9、9例，常氧1、2、3组分别为8、8、8例。低氧2组、CMS组肝组织中TWSG1蛋白相对表达量分别高于常氧2、3组，低氧1组、低氧2组、CMS组TWSG1蛋白相对表达量依次增高(P均<0.05)。结论 CMS大鼠肝组织中铁调素表达下调，TWSG1表达上调；随低氧暴露时间延长，机体铁调素和TWSG1表达变化越明显，预示CMS状态下铁代谢逐渐发生改变。

慢性高原病；扭转原肠胚形成同系物1；铁调素

慢性高原病(CMS)是长时间居住于海拔2 500 m以上地区的人群逐渐对低氧低压环境不适应而发生的临床综合征。CMS以红细胞过度增生、低氧血症为特征。铁调素是一种由HAMP基因编码的含有25个氨基酸的肝脏抗菌肽，是由8个半胱氨酸残基组成的单一发夹结构。铁调素通过与膜铁转运蛋白(FPN)结合并引起FPN内化降解从而调节机体铁稳态。铁调素受炎症因素和机体铁含量增加的正性调节，受红系增殖活性增加和缺氧的负性调节，上述过程主要有BMP-SMAD、JAK-STAT3和HFE-TfR2三条信号通路参与。扭转原肠胚形成同系物1(TWSG1)是近年来发现的铁调控蛋白。TWSG1是一个高度保守的分泌性糖蛋白，含有24个半胱氨酸残基和一个疏水的信号序列。有学者发现TWSG1能通过抑制BMP-SMAD信号转导间接抑制铁调素合成。经查阅国内外文献，有关CMS患者铁代谢基因表达的研究尚不多见。为此，我们制备了慢性高原病大鼠模型，观察大鼠肝组织中TWSG1、铁调素的表达变化，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性SPF级SD健康大鼠50只，鼠龄为42 d左右，体质量200～300 g，由西安交通大学第一附属医院提供。50只大鼠由西安运至西宁，适应性喂养1周后进行实验。将大鼠随机分为6组，低氧1组8只、低氧2组9只、CMS组9只、常氧1组8只、常氧2组8只、常氧3组8只。

1.2 CMS模型建立及判定标准 常氧1、2、3组分别在西宁(海拔2 260 m)常规饲养7、15、30 d。低氧1、2组和CMS组放入低压氧仓模拟海拔5 000 m环境，分别饲养7、15、30 d。CMS模型制作成功标准[1]：血红蛋白>210 g/L，红细胞比容>65%，有口唇、耳廓发绀等缺氧表现。根据判定标准，CMS组模型均制作成功。造模结束后麻醉大鼠，取腹主动脉血1 mL送检血常规；取出远离肝血管部位50 mg肝脏组织若干块，RNA later固定，用于铁调素、TWSG1 mRNA检测；取出一块远离肝血管部位的肝脏组织，4%多聚甲醛液固定，用于TWSG1蛋白检测。

1.3 大鼠肝组织中铁调素、TWSG1 mRNA检测 根据TRIzol使用说明书提取大鼠肝脏总RNA，选取OD260/OD280为1.8～2.0的RNA样本，依照试剂盒说明书进行逆转录。用Primer Premier5.0引物设计软件设计目的基因、内参基因actin引物序列，均由Invitrogen公司纯化合成。TWSG1基因上游引物序列为5′-ATGAGTGTTGCGATTGTGT-3′，下游引物序列为5′-TGAAGTGGGAGGTGTGTC-3′；铁调素基因上游引物序列为5′-CAACAGACGAGACAGACTACGG-3′，下游引物序列为5′-ACAAGGCTCTTGGCTCTCTATG-3′；内参β-actin基因上游引物序列为5′-CCTAGACTTCGAGCAAGAGA-3′，下游引物序列为5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGA-3′。qRT-PCR反应在ABI7500 PCR仪上进行，每组设阴性对照，每个样品设3个重复孔。PCR反应条件：94 ℃ 3 min,1个循环;94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s,35个循环。采用ABI7500软件进行数据分析，以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

1.4 大鼠肝组织中TWSG1蛋白检测 采用免疫组化法。肝组织标本经固定、脱钙、石蜡包埋、切片后，进行免疫组化染色。TWSG1阳性细胞为细胞核和细胞质呈棕黄色至棕褐色。根据着色程度、着色颗粒大小与阳性细胞百分比判定结果：无色计0分、淡黄色计1分、棕黄色计2分、棕褐色计3分，无颗粒计0分、细颗粒计1分、中颗粒计2分、粗颗粒计3分，无阳性细胞计0分、阳性细胞百分比≤25%计1分、>25%～50%计2分、>50%～75%计3分、>75%计4分；将三项得分相加，0～2分为-，3～5分为+，6～7分为++，8～9分为+++，10分为++++。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织中铁调素、TWSG1 mRNA表达比较 低氧2组、CMS组肝组织中铁调素mRNA相对表达量分别低于常氧2、3组，CMS组低于低氧1组(P均<0.05)。低氧1组、低氧2组、CMS组肝组织中TWSG1 mRNA相对表达量分别高于常氧1、2、3组，低氧1组、低氧2组、CMS组TWSG1 mRNA相对表达量依次增高(P均<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠肝组织中TWSG1蛋白表达比较 免疫组化染色结果见图1。低氧1组、低氧2组、CMS组TWSG1蛋白阳性分别为8、9、9例，常氧1、2、3组分别为8、8、8例。低氧2组、CMS组肝组织中TWSG1蛋白相对表达量分别高于常氧2、3组，低氧1组、低氧2组、CMS组TWSG1蛋白相对表达量依次增高(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肝组织中铁调素、TWSG1 mRNA及TWSG1蛋白表达比较

注：与低氧1组比较，▲P<0.05；与低氧2组比较，■P<0.05；与CMS组比较，★P<0.01。

注：A为常氧1组；B为常氧2组；C为常氧3组；D为低氧1组；E为低氧2组；F为CMS组。

3 讨论

CMS主要由机体缺氧造成的，慢性缺氧条件下(如慢性阻塞性肺疾病、右到左心脏分流术和高海拔环境)，低氧诱导因子(HIF)能通过协调细胞特定类型缺氧反应，包括增加肾脏和肝脏中促红细胞生成素(EPO)的生成、促进红系祖细胞成熟和增殖的骨髓微环境改变、提高铁摄取和利用等，从而促进红细胞生成[2]。红细胞生成增加源于骨髓来源的系统信号，这种系统信号抑制了铁调素的表达，研究[3]发现参与这种信号通路的因子可能包括骨髓中红系前体细胞产生的循环分子，如生长分化因子15(GDF15)及TWSG1。铁调素受抑制后FPN水平增高，进而增加用于红细胞生成的铁的可用性[2]。本课题分别设计了常氧组和低氧组，并模拟海拔5 000 m制备CMS大鼠模型，观察低氧状态及不同低氧暴露时间条件下大鼠肝组织中铁调素、TWSG1的表达变化，进而分析CMS对铁代谢的影响及其机制。

Nicolas等[4]在氧浓度为0.1%～2%的条件下培养HepG2细胞，发现与氧浓度为20%的常氧条件下相比，细胞中铁调素mRNA表达明显下降。研究[5]证明高海拔急性缺氧条件下，红细胞生成和血红蛋白合成所需的铁急剧增加，血浆铁调素浓度下降。有学者[6,7]发现CMS大鼠铁调素水平明显降低。本研究结果显示，低氧2组、CMS组肝组织中铁调素 mRNA相对表达量分别低于常氧2、3组，CMS组低于低氧1组，表明低氧环境下铁调素表达下调，在CMS状态下更加明显，其原因可能与低氧抑制铁调素表达有关。低氧抑制铁调素表达的途径可能包括：①低氧下启动HIF-1α直接与铁调素基因启动子上氧反应原件(HREs)作用，降低铁调素表达；②低氧能够通过HIF-1α使弗林蛋白酶(Furin)分泌增多，Furin是一种内质网中能分解铁调素调节蛋白(HJV)的蛋白酶，从而释放可溶性铁调素调节蛋白(sHJV)，而sHJV通过与BMPs结合、减少受体-配体相互作用，拮抗铁调素的作用；③低氧状态下HIF-1α可调节跨膜丝氨酸蛋白酶6(TMPRSS6)水平，并通过BMP-SMAD信号转导通路负性调节铁调素表达[8]；④通过血小板源性生长因子(PDGF)通路抑制铁调素合成[9]；⑤低氧使无调性同系物8(ATOH8)水平下降而发挥抑制铁调素的作用[10]；⑥低氧下HIF-2促使肾脏EPO生成和红细胞生成，骨髓来源的系统信号因子可能包括GDF-15和TWSG1抑制铁调素表达[3]。

Mirciov等[11]在β-地中海贫血、缺铁性贫血大鼠的骨髓和脾脏中检测到TWSG1和GDF15。TWSG1是细胞外基质中BMP信号调节器之一，它能根据环境正性或负性地调节BMP的活性[12～19]。有学者[20]研究发现TWSG1在恶性肝脏上皮细胞癌中表达增加，且与BMP4表达有关。Tanno等[13]在人肝癌细胞株HuH-7和初级人类肝脏细胞的研究中发现，TWSG1在红细胞生成的早期阶段(相对成熟阶段)表达增加，能通过抑制BMP2/BMP4与BMP受体结合，抑制Smad1/5/8的磷酸化，达到间接抑制铁调素合成的作用。Kroot等[14]进一步发现大鼠体内肾脏产物EPO促进红细胞生成，然后通过GDF15、TWSG1与肝脏细胞相关联，从而影响铁调素的表达，这可能是通过抑制BMP/SMAD信号转导完成的。

本研究结果显示，低氧1组、低氧2组、CMS组肝组织中TWSG1 mRNA相对表达量分别高于常氧1、2、3组，低氧1组、低氧2组、CMS组TWSG1 mRNA相对表达量依次增高；低氧2组、CMS组肝组织中TWSG1蛋白相对表达量分别高于常氧2、3组，低氧1组、低氧2组、CMS组TWSG1蛋白相对表达量依次增高。上述结果表明，随缺氧时间和缺氧程度的增加，TWSG1表达逐渐增加，且在CMS中维持高表达。分析其原因，CMS状态下，随缺氧时间和程度增加，红细胞生成对铁的需求增加，进一步通过GDF15/TWSG1介导HIF-2对铁调素表达的抑制作用，调节铁代谢，从而为红细胞生成提供充足的原料。但对于CMS状态下TWSG1与红系增殖之间的关系仍不明确。

总之，CMS大鼠肝组织中铁调素表达下调，TWSG1表达上调；随低氧暴露时间延长，机体铁调素和TWSG1表达变化越明显，预示铁代谢状态逐渐发生改变。

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青海省科技计划资助项目(2014-ZJ-720)。

耿惠(E-mail: gh0227@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.008

R594.3

A

1002-266X(2017)15-0031-04

2016-05-19)