DAPT对结肠癌细胞株HT-29增殖及乙醛脱氢酶1、Notch信号通路受体和配体表达的影响

赵小芳，王红

(1遵义医学院附属医院，贵州遵义563000；2遵义市第一人民医院)

DAPT对结肠癌细胞株HT-29增殖及乙醛脱氢酶1、Notch信号通路受体和配体表达的影响

赵小芳1，2，王红1

(1遵义医学院附属医院，贵州遵义563000；2遵义市第一人民医院)

目的 观察γ-分泌酶抑制剂(GSIs)DAPT对结肠癌细胞株HT-29增殖及结直肠癌肿瘤干细胞标志物乙醛脱氢酶1(ALDH1)、Notch信号通路受体Notch4、Notch信号通路配体DLL1表达的影响。方法 体外培养HT-29细胞，取对数生长期细胞用于实验。分别以0、5、10、20、40、80 μmol/L的DAPT作用于HT-29细胞24、48、72 h后，倒置显微镜下观察细胞形态，用MTT比色法检测细胞增殖能力(以OD值表示)。分别以0、20、40 μmol/L的DAPT作用于HT-29细胞24 h后，采用RT-PCR法检测细胞中的ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA，分别采用Western blotting法和免疫组化法检测ALDH1、Notch4、DLL1蛋白。分析HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA及蛋白表达的相关性。结果 DAPT对HT-29细胞的增殖抑制作用呈一定剂量、时间依赖性，40、80 μmol/L浓度组培养48、72 h时细胞增殖能力低于培养24 h时(P均<0.05)。DAPT处理后的细胞形态出现典型凋亡状态改变。20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA相对表达量低于0 μmol/L组(P均<0.05)。0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白相对表达量依次降低(P均<0.05)。免疫组化染色图像分析结果示，0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白表达OD值依次降低(P均<0.05)。HT-29细胞中ALDH1、DLL1 mRNA表达与Notch4 mRNA表达均呈正相关关系(r分别为0.997、0.998，P均<0.05)。HT-29细胞中ALDH1、DLL1蛋白表达与Notch4蛋白表达均呈正相关关系(r分别为0.998、0.999，P均<0.05)。结论 DAPT作用后，细胞增殖受到抑制，细胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA和蛋白表达下调；DAPT对HT-29细胞的增殖抑制作用可能与降低肿瘤干细胞特性、下调Notch信号通路受体与配体表达实现的。

结肠癌；HT-29细胞；γ-分泌酶抑制剂；(2S)-N-N-(3,5-氟苯乙酰基)-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯；肿瘤干细胞；乙醛脱氢酶1；Notch信号通路；Notch4；DLL1

近年来结直肠癌在我国的发病率、病死率呈逐年保持上升趋势，且发病年龄提前[1]，严重威胁人们健康。Notch信号通路参与肿瘤的发生发展。Notch受体和配体分子表达失调及Notch信号异常激活现象存在于多种恶性肿瘤中。研究[2，3]还发现，Notch信号通路是维持肿瘤干细胞特性的关键，肿瘤干细胞自我更新也需要Notch信号的调节。部分大肠癌的形成可能与Notch信号通路对结直肠肿瘤干细胞调控异常有关。本实验将Notch信号通路阻断剂γ-分泌酶抑制剂(GSIs)DAPT作用于结肠癌细胞HT-29，观察DAPT对HT-29增殖及结直肠癌肿瘤干细胞标志物ALDH1、Notch信号通路受体Notch4、Notch信号通路配体DLL1表达的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 结肠癌细胞株HT-29由遵义医学院消化内科研究所实验室常规传代保种，培养于含10%胎牛血清(FBS)的改良型1640培养基(美国Hyclone公司)中，静置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中。每48 h换液、传代1次，观察细胞生长情况，处于对数生长期细胞用于实验。MTT试剂购自中国凯基生物公司；二甲基亚砜(DMSO)及DAPT购于美国Sigma公司；RT-PCR逆转录试剂盒及扩增试剂盒均购自中国北京索莱宝科技有限公司；ALDH1单克隆抗体、Notch4单克隆抗体及DLL1多克隆抗体购于美国Abcam公司；倒置显微镜为日本Olympus公司产品。

1.2 DAPT对HT-29细胞增殖的影响观察 调整DAPT浓度为0、5、10、20、40、80 μmol/L，分别加入含有相同数目的HT-29细胞培养瓶中，分别培养24、48、72 h后PBS漂洗，将培养瓶置于Olympus倒置显微镜下观察细胞形态并拍摄照片。采用MTT法观察细胞增殖情况。取对数生长期的细胞消化制成单细胞悬液，接种于96孔板内，每孔100 μL细胞悬液，接种密度为1×104/mL，贴壁后血清培养细胞。将细胞分组，每组设置5个复孔，分别加入0、5、10、20、40、80 μmol/L的DAPT和10%FBS-1640培养基100 μL，并以0.2%体积分数的DMSO替代DAPT作为溶酶对照组。使用MTT比色法观察培养24、48、72 h后细胞增殖情况，实验重复3次。以OD值代表细胞增殖能力。

1.3 DAPT对HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1表达的影响观察 取对数生长期的HT-29细胞，以5×104/孔接种于12孔板，置于恒温培养箱中培养，培养24 h后分别加入含0、20、40 μmol/L DAPT的10%FBS-1640培养基2 mL，用于Notch4、DLL1、ALDH1 mRNA和蛋白检测。

1.3.1 ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA检测 按照RT-PCR试剂盒说明书提取细胞总RNA，总RNA定量为0.2 μg/μL。将mRNA逆转录为cDNA，反应条件为37 ℃×15 min，85 ℃×5 s，4 ℃保持。cDNA产物放-20 ℃冰箱保存备用。ALDH1基因上游引物序列为5′-TTGTCCAGCCCACAGTGTTCTC-3′，下游引物序列为5′-TGTCTTTGGTAAACACTCCTGCTGA-3′；Notch4基因上游引物序列为5′-CTTCGGGACTTCTGTTCAGC-3′，下游引物序列为5′-TCGTTGACATCACGTTCACA-3′；DLL1基因上游引物序列为5′-GATGTGATGAGCAGCATGGA-3′，下游引物序列为5′-CCATGGAGACAGCCTGGATA-3′；内参基因β-actin上游引物序列为5′-TGGCACCCAGCACAATGA-3′，下游引物序列为5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG-3′。按扩增体系进行扩增，扩增反应条件：95 ℃×5 min、95 ℃×30 s、56.9 ℃退火×30 s、72 ℃×1 min 30 s、72 ℃×10 min；扩增产物-20 ℃冰箱保存。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

1.3.2 ALDH1、Notch4、DLL1蛋白检测 ①Western boltting法：按照试剂盒说明提取细胞总蛋白，于酶标仪上做蛋白定量测量；按Western boltting实验步骤进行凝胶电泳，用脱脂奶粉封闭1 h，分别加入最适比例的相应一抗和β-actin，4 ℃冰箱摇床上封闭过夜，洗膜后加入与一抗来源相同的二抗(1∶5 000)；显色曝光，扫描仪扫描胶片，用Image-plus软件测量灰度值，结果用Image Pro Plus图像处理软件统计灰度值，以目的蛋白IOD值/内参β-actin IOD值表示蛋白相对表达量。②免疫组化法：按照免疫组化染色步骤进行，一抗4 ℃孵育过夜，加二抗生物素标记的山羊抗大鼠IgG工作液50 μL，培养30 min，DAB显色剂显色，显微镜下观察，ALDH1、Notch4、DLL1阳性细胞为细胞膜和(或)细胞质中出现黄色至棕色颗粒，采集图像后用Image Pro Plus6.0图像分析软件进行分析，得出OD值，计算视野内平均OD值。

2 结果

2.1 DAPT对HT-29细胞增殖的影响 与未用DAPT处理细胞对比，DAPT处理后的细胞形态出现典型凋亡状态改变：细胞呈近似圆形或椭圆形，细胞间隙增大，数量逐渐减少，细胞分散，细胞轮廓欠清晰，部分胞体变圆。相同时间下，DAPT作用浓度增高，细胞增殖能力下降；相同DAPT作用浓度下，随作用时间延长，细胞增殖能力也下降；DAPT对HT-29细胞的增殖抑制作用呈一定剂量、时间依赖性，其中40、80 μmol/L浓度组培养48、72 h时细胞增殖能力低于培养24 h时(P均<0.05)。详见表1。

表1 不同浓度DAPT作用不同时间后各组细胞增殖能力比较

注：与相同培养时间对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与相同浓度培养24 h时比较，#P<0.05。

2.2 DAPT对HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA表达的影响 20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA相对表达量低于0 μmol/L组(P均<0.05，见表2)。

表2 不同浓度DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA及蛋白表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与20 μmol/L组比较，#P<0.05。

2.3 DAPT对HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白表达的影响 0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白相对表达量依次降低(P均<0.05)，见表2。免疫组化染色显示，0 μmol/L组细胞胞膜、胞质呈棕黄色染色，细胞形态正常；20、40 μmol/L组ALDH1、Notch4、DLL1阳性细胞数量较0 μmol/L组减少，且着色程度减弱。0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1蛋白OD值分别为2.00±0.24、1.03±0.09、0.54±0.10，Notch4蛋白表达OD值分别为1.33±0.19、0.86±0.11、0.27±0.05，DLL1蛋白表达OD值分别为1.08±0.10、0.72±0.12、0.33±0.05，0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白OD值依次降低(P均<0.05)。

2.4 HT-29细胞中ALDH1、DLL1、Notch4 mRNA及蛋白表达的相关性 HT-29细胞中ALDH1、DLL1 mRNA表达与Notch4 mRNA表达均呈正相关关系(r分别为0.997、0.998，P均<0.05)。HT-29细胞中ALDH1、DLL1蛋白表达与Notch4蛋白表达均呈正相关关系(r分别为0.998、0.999，P均<0.05)。

3 讨论

Notch信号通路几乎存在于所有的细胞、生物中，是一个高度保守的系统，介导细胞增殖、分化、迁移、凋亡，参与造血、胚胎发育、结直肠上皮细胞成熟、免疫细胞成熟等过程，且在相邻细胞细胞间的互相联系中也发挥重要作用[4]。已有研究[5]发现Notch信号通路分子在许多恶性肿瘤中呈异常表达，如胰腺癌、前列腺癌、尤因肉瘤、宫颈癌和结肠癌等。Notch1和Hes-1高表达与结直肠癌分期、耐药有关[6]，Notch3表达与Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌的复发密切相关[7]，但Notch2表达与结直肠癌进展呈负相关[8]。有学者[9]发现DLLl基因表达异常可能与结直肠癌早期发病有关，由此推测Notch信号通路分子可能成为肿瘤早期诊断和预防的重要靶点。

Notch信号通路中有三个肿瘤治疗靶点[10]：①抑制NICD释放，如使用GSIs DAPT[11，12]；②阻断受体与配体的结合，如shRNA沉默大肠癌细胞中Jagged1表达；③作用于共激活复合物，如使用CLS的小分子抑制性肽以减少靶基因的转录活化[13]。本实验选择的Notch信号通路抑制剂为DAPT，一种人工合成的非选择性GSIs，可阻断Notch受体第三步酶切过程，使Notch受体分子无法转变成有效的活性片段，从而抑制Notch信号通路激活，阻止Notch活化[14]。且DAPT细胞毒性小，即使阻断γ-分泌酶而引起底物堆积也不会产生毒性作用。本研究分别将不同浓度的DAPT作用于HT-29细胞，结果显示，相同时间下，随着DAPT作用浓度增高，细胞增殖能力逐渐下降；而在相同DAPT作用浓度下，随作用时间延长，细胞增殖能力也逐渐下降；DAPT对HT-29细胞的增殖抑制作用呈一定剂量、时间依赖性；DAPT处理后的细胞出现典型凋亡状态改变。这说明DAPT可抑制HT-29细胞增殖，诱导其发生凋亡，具有一定的抗肿瘤作用。

研究[15]证实，人结直肠癌组织中肠道干细胞表面标志物高表达，后者可通过作用于Notch、Wnt等通路导致肿瘤形成。干细胞表面标志物检测有助于对正常干细胞和肿瘤干细胞进行鉴别[16]。ALDH1是乙醛脱氢酶家族之一，参与多种组织的分化与基因表达，也是正常干细胞与肿瘤干细胞生长、分化的必需物质，在肿瘤发展过程中也发挥重要作用。已有研究[17]显示，Notch诱导ALDH1A1去乙酰化可能与肿瘤高侵袭性有关。本研究结果显示，20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA相对表达量低于0 μmol/L组；0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白相对表达量依次降低。由上可见结肠癌细胞中高表达的ALDH1经Notch信号通路抑制剂DAPT作用后表达下调，且细胞中Notch信号通路分子Notch4和DLL1表达也发生下调，推测DAPT对结肠癌细胞的增殖抑制、促凋亡作用与降低肿瘤干细胞特性、下调Notch信号通路受体与配体表达有关。另外，本研究还发现HT-29细胞中ALDH1、DLL1 mRNA表达与Notch4 mRNA表达呈正相关关系，ALDH1、DLL1蛋白表达与Notch4蛋白表达也呈正相关关系，提示ALDH1、DLL1、Notch4在结肠癌细胞增殖中存在协同作用，详细机制有待进一步研究。

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Effects of DAPT on proliferation of colon cancer cell line HT-29, expression of ALDH1, Notch signaling pathway receptor and ligand

ZHAOXiaofang1,WANGHong

(1AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China)

Objective To observed the effects of γ-secretase inhibitors (GSIs) DAPT on proliferation of colon cancer cell line HT29, colorectal tumor stem cell marker aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1), Notch signaling pathway receptor Notch4 and Notch signal pathway ligand DLL1 expression. Methods HT-29 cells were cultured in vitro, and the cells in the logarithmic phase were used in the experiment. DAPT (0, 5, 10, 20, 40, 80 umol/L) was used to treat HT-29 cells for 24, 48 and 72 h, we observed the cell morphology under inverted microscope, detected the cell proliferation ability by MTT colorimetry (OD value). DAPT (0, 20, 40 μmol/L) was used to treat HT-29 cells for 24 h, the ALDH1, Notch4, DLL1 mRNA was detected by RT-PCR, the ALDH1, Notch4, DLL1 protein was detected using Western blotting and immunohistochemistry. The correlation of ALDH1, Notch4, DLL1 mRNA and protein expression in HT-29 cells was analyzed. Results The proliferation inhibition of DAPT on HT-29 cells was in a dose- and time-dependent manner. The proliferation ability of cells at 48, 72 h was lower than that at 24 h in the 40, 80 umol/L groups (P<0.05). Cells showed typical apoptosis state change after DAPT treatment. The mRNA expression of ALDH1, Notch4 and DLL1 in HT-29 cells treated with 20, 40 umol/L DAPT was lower than that treated with 0 umol/L DAPT (allP<0.05). The protein expression of ALDH1, Notch4 and DLL1 in HT-29 cells treated with 0, 20, 40 μmol/L DAPT was decreased successively (allP<0.05). Immunohistochemical image analysis, the OD value of protein expression of ALDH1, Notch4, and DLL1 in HT-29 cells treated with 0, 20, 40 umol/L DAPT was reduced in turn (allP<0.05). The mRNA expression of ALDH1 and DLL1 in HT-29 cells was positively correlated with Notch4 mRNA expression (r=0.997, 0.998; allP<0.05). The protein expression of ALDH1and DLL1 was positively correlated with Notch4 protein expression in the HT-29 cells (r=0.998, 0.999, allP<0.05). Conclusions After DAPT treatment, the cell proliferation is inhibited and the mRNA and protein expression of ALDH1, Notch4 and DLL1 is down-regulated. The proliferation inhibition of DAPT on HT-29 cells may be related to reducing the cancer stem cell properties and down-regulating Notch signaling pathwayreceptor and ligand expression.

colorectal carcinoma; HT-29 cells; γ-secretase inhibitors; (2S)-NN-(3,5-fluorophenylacetyl) -L-alanyl-2-phenylglycine tert-Aldehyde dehydrogenase 1; tumor stem cells; aldehyde dehydrogenase 1; Notch signaling pathway; Notch4; DLL1

贵州省科技计划项目(黔科合SY字2013-3006)；贵州省科学技术基金资助项目(黔科合SY字2010-2172)。

赵小芳(1986-)，女，硕士，主要研究方向为结直肠癌的防治。E-mail: 627813412@qq.com

王红(1971-)，女，主任医师，主要研究方向为结直肠癌的防治。E-mail: wanghong89zy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.002

R735.3

A

1002-266X(2017)15-0005-04

2016-10-21)