CYFIP1过表达的鼻咽癌细胞株CNE2增殖、迁移能力观察

林中原，李音音，石祥，李文朝，莫丽军，黎小红，莫武宁

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

CYFIP1过表达的鼻咽癌细胞株CNE2增殖、迁移能力观察

林中原，李音音，石祥，李文朝，莫丽军，黎小红，莫武宁

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的 观察胞质FMRP相互作用蛋白1(CYFIP1)过表达的鼻咽癌细胞株CNE2增殖、迁移能力变化。方法 将含CYFIP1基因片段和空载片段的慢病毒转染鼻咽癌细胞株CNE2，分别作为实验组和空载组；以不进行转染操作的CNE2细胞为对照组。分别于培养24、48、72、96 h采用MTT实验观察各组细胞增殖情况(以OD值表示)。进行细胞克隆形成实验，待平板中出现肉眼可见克隆时，终止培养并计算克隆形成数。分别采用划痕实验和Transwell迁移实验观察细胞迁移能力，测量细胞迁移距离，记录穿膜细胞数。结果 三组不同培养时间OD值相比，P均>0.05。实验组、空载组和对照组克隆形成数分别为(414±29)、(426±30)、(381±59)个，三组相比，P均>0.05。实验组、空载组、对照组细胞相对迁移距离分别为(6.71±0.10)、(9.82±0.12)、(9.98±0.10)mm，实验组细胞迁移距离小于空载组和对照组(P均<0.05)。实验组、空载组、对照组穿膜细胞数分别为(37.33±1.53)、(62.67±5.03)、(62.13±4.36)个，实验组穿膜细胞数少于空载组和对照组(P均<0.05)。结论 CYFIP1过表达的鼻咽癌细胞株CNE2迁移能力受到抑制。CYFIP1表达异常可能与鼻咽癌的浸润、发展有关。

鼻咽癌；鼻咽癌细胞；胞质FMRP相互作用蛋白1；细胞增殖；细胞迁移

鼻咽癌在我国的发病率和病死率均较高[1]，鼻咽癌好发于咽隐窝，早期可出现鼻腔出血、头痛等症状，晚期可出现颅神经损害、淋巴结肿大及远处转移等[2]。鼻咽癌初发隐匿性高，病情发展迅速且容易发生远处转移，治疗效果有限，5年复发率高达88.3%[3]，但发病机制尚未明确。已知鼻咽癌的发生发展与多种因素有关，包括EB病毒感染、环境因素和遗传因素等。抑癌基因可调节细胞正常发育、生长和分化，在抑制细胞增殖和细胞迁移中发挥重要作用，抑癌基因失活是恶性肿瘤的一大特征[4]。胞质FMRP相互作用蛋白1(CYFIP1)被认为是候选的抑癌基因。CYFIP1在部分肿瘤如肺癌、乳腺癌、食道癌和卵巢癌等组织中低表达，然而其表达变化是否影响鼻咽癌的发生发展尚不清楚。我们前期研究发现CYFIP1基因在鼻咽癌组织中的表达水平低于正常鼻咽组织。本研究观察了CYFIP1过表达的鼻咽癌细胞株CNE2增殖、迁移能力变化，探讨CYFIP1与鼻咽癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 低分化鼻咽癌细胞株CNE2(一种CYFIP1低表达细胞株)为广西医科大学耳鼻喉实验室获得。含CYFIP1基因片段和空载片段的慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司设计并包装。总RNA提取试剂RNAiso Plus reagent、逆转录试剂PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser reagent和cDNA扩增试剂SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ购自日本TaKaRa公司，RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司，嘌呤霉素和MTT试剂购于美国Sigma公司，Transwell小室购自美国Corning公司，蛋白提取试剂RIPA lysis buffer、4%多聚甲醛和1%结晶紫染液购自北京索莱宝公司，BCA蛋白质分析试剂购自北京碧云天公司。

1.2 CYFIP1转染与细胞分组 分别将含CYFIP1基因片段和空载片段的慢病毒转染鼻咽癌细胞株CNE2，荧光显微镜下见细胞中有绿色荧光后用含2 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基培养筛选，获得稳定细胞株CYFIP1-CNE2和empty vector-CNE2，分别作为实验组和空载组;以不进行转染操作的CNE2细胞为对照组。三组细胞使用含10%胎牛血清和1%混合抗生素(青霉素和链霉素)的RPMI1640培养，培养条件为37 ℃、5% CO2。分别采用实时荧光定量PCR法和Western blotting法检测CYFIP1 mRNA及蛋白，结果显示，实验组、空载组和对照组CYFIP1 mRNA相对表达量分别为3.491±0.169、1.079±0.037、1.000±0.010，CYFIP1蛋白相对表达量分别为0.326±0.018、0.169±0.013、0.149±0.011，实验组细胞中CYFIP1 mRNA及蛋白相对表达量高于空载组、对照组(P均<0.05)。详见图1。表明CYFIP1过表达CNE2细胞构建成功。

图1 各组细胞中CYFIP1蛋白电泳结果

1.3 细胞增殖能力观察 ①MTT实验：用0.25%胰蛋白酶消化各组细胞并重悬，以2×103/孔种到96孔板中；分别于孵育24、48、72、96 h后添加5 mg/mL的MTT 25 μL，37 ℃孵育4 h，加入100 μL二甲基亚砜充分溶解晶体；采用酶标仪测量490 nm波长的吸光度值(OD值)。②细胞克隆形成实验：培养各组细胞至对数生长期，0.25%胰蛋白酶消化细胞并用完全培养基重悬，以500/孔种到6孔板中，在37 ℃、5% CO2环境下培养；每3 d更换一次培养基，培养至平板出现肉眼可见的细胞团时终止细胞培养，用4%多聚甲醛固定细胞，1%结晶紫染色；将细胞数大于30个的细胞团记为一个克隆，计算各组克隆数。

1.4 细胞迁移能力观察 ①划痕实验：三组细胞按2×106/孔种在6孔板中，待第2天细胞贴壁后用黄色吸头在细胞中画线形成划痕，PBS洗去漂浮细胞。每孔添加无血清培养基，分别于培养0、48、96 h后用Olympus显微镜拍照记录划痕区域的变化，测量周边细胞向划痕区域中央迁移的距离。②Transwell迁移实验：培养各组细胞至对数生长期并用胰酶消化，将含2×104个细胞的无血清细胞悬液200 μL添加至小室上层，小室下层添加含10%血清的培养基500 μL，48 h后终止细胞培养，用4%多聚甲醛固定细胞后1%结晶紫染色；轻轻擦去小室上层未穿膜细胞，在空气中晾干小室，用Olympus显微镜观察穿膜细胞并进行统计。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 三组不同培养时间OD值相比，P均>0.05(见表1)。实验组、空载组和对照组克隆形成数分别为(414±29)、(426±30)、(381±59)个，三组相比，P均>0.05(见图2)。

表1 各组细胞增殖能力比较

图2 各组细胞克隆情况

2.2 各组细胞迁移能力比较 实验组、空载组、对照组在96 h的相对迁移距离为(6.71±0.10)、(9.82±0.12)、(9.98±0.10)mm，实验组细胞迁移距离小于空载组和对照组(P均<0.05)。详见图3。实验组、空载组、对照组穿膜细胞数分别为(37.33±1.53)、(62.67±5.03)、(62.13±4.36)个，实验组穿膜细胞数少于空载组和对照组(P均<0.05)。详见图4。

图3 各组细胞迁移情况

图4 各组细胞Transwell小室穿膜细胞

3 讨论

鼻咽癌发病具有地理分布特点，多发于北非和东南亚，尤其在中国南方地区多发[5]。鼻咽癌病情发展迅速，早期非特征性症状(如耳鸣、流鼻血等)使该病早期检出率不高，超过半数的鼻咽癌患者被确诊时已处于晚期阶段，而且10%的患者在初次就诊时就已经存在肿瘤远处转移。鼻咽癌可转移至多种器官，如脾脏、肝脏、肺和骨组织等[6～8]，极大增加了鼻咽癌的治疗难度。有17%～54%的鼻咽癌患者因肿瘤远处转移而错失治疗良机[9,10]。目前鼻咽癌的发病及远处转移的机制尚未完全清楚。抑癌基因是正常细胞生长活动的负性调节因子，其表达丢失或功能受到抑制与恶性肿瘤的发病密切相关。研究[11～14]表明，鼻咽癌的发生发展经历p53、NAG7、WWOX等抑癌基因的失活，鼻咽癌细胞的增殖和迁移可被TESTIN、PTEN等基因抑制。鼻咽癌细胞的生物学功能与抑癌基因表达水平密切相关。

CYFIP1基因位于染色体15q11.2区域，参与组成蛋白复合物CYFIP1-FMRP-eIF4E和CYFIP1-NCKAP1-WAVE1-ABI2[15]。CYFIP1对突触形态和功能的维持至关重要，可抑制mRNA翻译突触后蛋白。CYFIP1功能缺陷可能导致突触功能障碍，引起神经系统疾病如智力障碍、自闭症和精神分裂症等。CYFIP1作为候选抑癌基因，其在肺癌、乳腺癌、结肠癌和膀胱癌发病中的作用都有报道。Teng等[16]报道称CYFIP1可限制WASF3的激活，而WASF3的激活可促进乳腺癌和前列腺癌细胞迁移。Beggs等[17]通过处理eIF4E/CYFIP1复合体间接发现舌癌中CYFIP1表达能抑制细胞迁移。然而CYFIP1对鼻咽癌发生发展的影响尚未见报道。我们前期实验发现CYFIP1在鼻咽癌组织中的表达水平低于正常鼻咽组织，因此，我们猜想鼻咽癌组织中CYFIP1的低表达和病情发展存在一定联系。本研究观察了CYFIP1过表达的鼻咽癌细胞株CNE2增殖、迁移能力变化，结果显示，实验组、空载组和对照组OD值和克隆形成数差异均无统计学意义，但实验组细胞迁移距离小于空载组和对照组，穿膜细胞数少于空载组和对照组，提示CYFIP1可能参与鼻咽癌的发展，其高表达可抑制细胞迁移。

CYFIP1如何影响鼻咽癌细胞的迁移尚未清楚。CYFIP1是一种eIF4E结合蛋白。eIF4E与帽状结构的mRNA之间具有亲和力，可通过结合m7GTP帽端结构5′UTR与mRNA连接，并诱导43S起始前复合物与mRNA结合形成活跃的翻译起始复合物[18]。CYFIP1作为一种抑制蛋白，与eIF4E结合后可阻止活化多核糖体的形成，从而抑制细胞迁移相关蛋白表达[17]。CYFIP1/eIF4E复合体参与调控mRNA翻译的稳定性。此外，CYFIP1也参与组成Scar/WAVE复合体，调控肌动蛋白细胞骨架结构形成。Scar/WAVE复合体通常以失活形式存在，可被GTPase Rac1激活，使Scar/WAVE复合体c端VCA区域处于开放状态，促使Arp2/3复合体构建肌动蛋白网。由CYFIP1调控的肌动蛋白组装异常可导致细胞支架结构异常，从而影响细胞之间的稳定性[19]。Silva等[20]报道称上皮细胞肿瘤中CYFIP1常见突变类型为杂合性缺失。然而，CYFIP1的失活机制仍待研究。

综上所述，CYFIP1过表达的鼻咽癌细胞株CNE2迁移能力受到抑制。CYFIP1表达异常可能与鼻咽癌的浸润、发展有关。CYFIP1可能成为反映鼻咽癌细胞迁移能力的新指标，具体机制仍待更进一步研究。

[1] 黄光武.鼻咽癌的基础研究[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2010,17(3):113-115.

[2] 马益如,闵华庆.鼻咽癌的临床表现和诊断[J].实用肿瘤杂志,1990,5(1):1-3.

[3] 谢国丰,曹卡加,胡丹,等.111例鼻咽癌复发部位的分析[J].中国肿瘤,2010,19(1):67-69.

[4] 莫武宁.鼻咽癌与遗传基因的关系[J].广西医学,1999,21(2):265-268.

[5] Wang HY, Chang YL, To KF, et al. A new prognostic histopathologic classification of nasopharyngeal carcinoma[J]. Chin J Cancer, 2016,35(1):41.

[6] Genova P, Brunetti F, Bequignon E, et al. Solitary splenic metastasis from nasopharyngeal carcinoma: a case report and systematic review of the literature[J]. World J Surg Oncol, 2016,14(1):184.

[7] Li W, Bai Y, Wu M, et al. Combined CT-guided radiofrequency ablation with systemic chemotherapy improves the survival for nasopharyngeal carcinoma with oligometastasis in liver: Propensity score matching analysis[J]. Oncotarget, 2016,doi:10.18632/oncotarget.10383.

[8] Wang HM, Lin TL, Kuo YC, et al. Correlation between overall survival and differential plasma and tissue tumor marker expression in nasopharyngeal carcinoma patients with different sites of organ metastasis[J]. Oncotarget, 2016,7(33):53217-53229.

[9] Jin Y, Shi YX, Cai XY, et al. Comparison of five cisplatin-based regimens frequently used as the first-line protocols in metastatic nasopharyngeal carcinoma[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012,138(10):1717-1725.

[10] Tan WL, Tan EH, Lim DW, et al. Advances in systemic treatment for nasopharyngeal carcinoma[J]. Chin Clin Oncol, 2016,5(2):21.

[11] 丁洁琼,何志巍.鼻咽癌发生发展相关的癌基因和抑癌基因[J].现代肿瘤医学,2007,15(10):1512-1515.

[12] 兰会华,莫武宁,黄华艺.WWOX、p53及Bcl-2在鼻咽癌中的表达及意义[J].华中科技大学学报(医学版),2014,43(1):59-63.

[13] Zhong Z, Zhang F, Yin SC. Effects of TESTIN gene expression on proliferation and migration of the 5-8F nasopharyngeal carcinoma cell line [J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2015,16(6):2555-2559.

[14] Zhang LY, Ho-Fun Lee V, Wong AM, et al. MicroRNA-144 promotes cell proliferation, migration and invasion in nasopharyngeal carcinoma through repression of PTEN[J]. Carcinogenesis, 2013,34(2):454-463.

[15] Wang J, Tao Y, Song F, et al. Common regulatory variants of CYFIP1 contribute to susceptibility for autism spectrum disorder (ASD) and classical autism[J]. Ann Hum Genet, 2015,doi: 10.1111/ahg.12121.

[16] Teng Y, Bahassan A, Dong D, et al. Targeting the WASF3-CYFIP1 complex using stapled peptides suppresses cancer cell invasion[J]. Cancer Res, 2016,76(4):965-973.

[17] Beggs JE, Tian S, Jones GG, et al. The MAP kinase-interacting kinases regulate cell migration, vimentin expression and eIF4E/CYFIP1 binding[J]. Biochem J, 2015,467(1):63-76.

[18] Di Marino D, D′Annessa I, Tancredi H, et al. A unique binding mode of the eukaryotic translation initiation factor 4E for guiding the design of novel peptide inhibitors[J]. Protein Science, 2015,24(9):1370-1382.

[19] Machesky LM, Tang HR. Actin-based protrusions: promoters or inhibitors of cancer invasion[J]. Cancer Cell, 2009,16(1):5-7.

[20] Silva JM, Ezhkova E, Silva J, et al. Cyfip1 is a putative invasion suppressor in epithelial cancers[J]. Cell, 2009,137(6):1047-1061.

Observation of proliferation and migration in nasopharyngeal carcinoma cells with over-expression of CYFIP1

LINZhongyuan,LIYinyin,SHIXiang,LIWenchao,MOLijun,LIXiaohong,MOWuning

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the changes in the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells with over-expression of cytoplasmic FMRP interacting protein 1 (CYFIP1). Methods A human nasopharyngeal carcinoma cell line (CNE2) was infected with a lentiviral vector containing CYFIP1 or the empty vector, which were used as the experimental group and blank group. The uninfected CNE2 cells acted as the control group. Cell proliferation was evaluated by MTT (represented by OD value) after cell culture for 24, 48, 72 and 96 h, separately. In clone formation assays, the cell culture was terminated when clones in plate could be seen by naked eyes and clones were counted. Cell migration was analyzed by Transwell chamber and Scratch assays. The cell migration distance and the number of penetrating cells were calculated. Results No significant difference was found in the OD value at different cell-culture time among these three groups (P>0.05). The number of clones in the experimental group, blank group and control group were 414±29, 426±30 and 381±59, respectively (P>0.05). The cell migration distance of the experimental group, blank group and control group was (6.71±0.1), (9.82±0.12) and (9.98±0.1) mm, respectively. Compared with the blank group and control group, the experimental group had a shorter migration distance (allP<0.05). The penetrating cells of the experimental group, blank group and control group were 37.33±1.53, 62.67±5.03 and 62.13±4.36. The experimental group had less penetrating cells than those of the blank group and control group (allP<0.05). Conclusions The cell migration of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2 with over-expression of CYFIP1 is inhibited. Abnormal expression of CYFIP1 maybe participates in the invasion and development of nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal carcinoma; nasopharyngeal carcinoma cells; cytoplasmic FMRP interacting protein 1; cell proliferation; cell migration

广西壮族自治区自然科学基金资助项目(2014GXNSFAA118228)。

林中原(1989-)，男，硕士研究生在读，主要研究方向为鼻咽癌的发病机制。E-mail: 261608602@qq.com

莫武宁(1963-)，女，教授，主要研究方向为肿瘤免疫、分子生物学。E-mail: mown16300@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.005

R739.6

A

1002-266X(2017)15-0017-04

2016-11-18)