脐带间充质干细胞治疗烧伤的研究进展

刘烜凯 综述，张 伟 审校

脐带间充质干细胞治疗烧伤的研究进展

刘烜凯 综述，张 伟 审校

（潍坊医学院整形外科研究所 山东 潍坊 261041）

人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）是指存在于新生儿脐带中的一种多功能干细胞，具有自我更新及多向分化潜能。与其他组织来源的干细胞相比，hUCMSCs具有来源广泛、增值速度快、易于分离、低免疫原性、高安全性和不违背伦理道德等优点，被认为是再生医学领域中一种具有广泛临床应用前景的细胞。近年来对其基本生物学特性、体外诱导分化能力、体内移植促进皮肤创面修复等的研究，为烧伤患者的临床治疗提供新方向。本文就近年来hUCMSCs治疗烧伤的研究进展进行综述。

脐带间充质干细胞；烧伤；修复

烧伤是临床外科常见的意外伤害之一，严重威胁着人类的健康。据世界卫生组织（WHO）发布的统计数据显示，在2004年全球约1100万人因烧伤而需要救治，每年约31万人因烧伤死亡[1]。深度烧伤可使全身多个器官出现器质性病变和功能下降，尤其是烧伤所引发的多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome, MODS），占烧伤病人死亡原因的第一位[2]。到目前为止，虽然烧伤导致的内环境紊乱、炎性因子表达、器官结构功能改变等确切损害机制仍不完全明确，但诸多研究显示，烧伤的愈合与损伤部位细胞的水肿坏死程度、炎性因子及氧自由基释放、肉芽组织和新生血管生成、瘢痕修复重建等关系密切，特别是烧伤后机体因体液大量丢失导致的低血容量性休克更值得关注，有效血容量的急剧减少导致循环血量和心排量减少，组织灌注不足，细胞代谢及功能紊乱，组织修复更新能力下降，创面延迟愈合或不愈合[3]。目前已有研究表明在烧伤后应用间充质干细胞可以有效抑制炎性因子增生，促进抗炎因子释放，从而改善损伤局部微环境，加快烧伤创面的愈合[4-5]。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCS)是一种具有强大的增殖能力和多向分化潜能的干细胞，来源非常广泛，多存在于骨髓、脐血、脐静脉内皮下层、脂肪、外周血及肌肉等各种组织中。因其具有自我更新、自我繁殖、保存简便、多向分化和强大的分泌功能等特点使之成为许多临床疾病治疗的种子细胞[6-7]。其中，人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)是从人脐带华通胶中分离出来的一种基质细胞，与其他来源的干细胞相比，其具有增殖率高、易于分离、便与检测、不违背伦理道德和无免疫原性或低免疫原性，植入体内有良好的组织相容性，无明显排斥反应，生物安全性高等优点[8-9]。hUCMSCs取材可以在微创甚至无创条件下进行，从而避免或减少对机体的损伤，在适宜的环境下，可以体外诱导分化、体内进行移植促进皮肤创面修复，在烧伤治疗方面具有广阔的应用前景，已成为目前国内外研究的热点，现就hUCMSCs的来源、生物学特性和在烧伤治疗中的研究进展进行综述。

1 hUCMSCs的来源、分离及培养

1.1 hUCMSCs的来源：脐带是连于胎盘间与胚胎脐部的索状结构，其内有闭锁的卵黄蒂和尿囊结构，还有一条脐静脉和两条脐动脉组成，脐血管的一端与胎盘绒毛血管相连，另一端与胚胎血管续连。脐血管间填充着蛋白多糖及各种胶原蛋白组成的凝胶状结缔组织，即华通胶或沃顿胶（Wharton´s jelly, WJ)，外层再被羊膜所包裹[10]。足月产胎儿的脐带是脐带间充质干细胞的主要来源，羊膜、华通胶、脐血和脐血管内膜均可分离得到干细胞，而脐带华通胶中富含的基质细胞即hUCMSCs[11]。

1.2 hUCMSCs的分离和培养：脐带是富含胶原和葡萄糖胺聚糖（主要为透明质酸）的组织，故多采用酶消化法分离细胞，此外还使用组织块贴壁法或两者相结合的方法分离培养[12]。1991年，McElreavey等[13]成功从人脐带WJ组织中分离培养出一种具有高分化潜能和多向分化能力的成纤维样细胞。Romanov等[14]研究人脐带血管周围细胞，在培养后有较高的成纤维样集落形成能力。上述研究说明脐带可以成功分离培养出hUCMSCs。

2 hUCMSCs的生物学特性

2.1 hUCMSCs的生长特性：hUCMSCs在显微镜下呈现出成纤维细胞样结构，胞质丰富，具有贴壁生长的特性，可稳定传代，且传代后细胞具有很高的增殖率，生长迅速。徐燕等[15]采用组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞，细胞第4天进入对数生长期，维持至第8天，进入平台增殖期，倍增时间为45h，且保持稳定生长。

2.2 hUCMSCs表面标志物：和其他来源的MSCs一样，流式细胞仪分析显示hUCMSCs表面表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49、CD58及 HLAABC，不表达CD14、CD34、CD45、CD31、CD33、CD38、CD80、CD86、CD40、CD144、CD56及HLA-DR等[11-12]。特别是人间充质干细胞标记的黏附分子受体CD44、CD90和间质细胞受体CD73(SH-3)、CD105(SH-2)均呈现高表达状态。

2.3 hUCMSCs的分泌功能：相关研究表明，hUCMSCs能够分泌胰岛素样生长因子1（IGFs-1)、肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和血小板生长因子（PDGF）等[16]。卓华丽等[17]体外分离培养人脐带间充质干细胞，将第3代细胞消化后以1×105/孔接种于24孔培养板，用添加12%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养3d，收集细胞和培养上清用RT-PCR和 ELISA分析表皮生长因子（EGF）、干细胞因子（SCF）、集落刺激因子1（CSF1）和白血病抑制因子（LIF）的表达情况。RT-PCR结果显示，hUCMSCs转录表达基因SCF、LIF、CSF1和EGF的mRNA；ELISA结果显示，胞浆提取物和上清均检测到SCF和CSF1，EGF在培养上清液中能检测。此研究充分说明了hUCMSCs的分泌功能。

2.4 hUCMSCs的多向分化能力：hUCMSCs在不同的诱导条件下不仅可以分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，还可分化为心肌细胞、内皮细胞、神经细胞和生殖细胞等，具有强大的分化增殖潜能。赵贵芳[18]在研究中，运用成脂诱导液诱导分化后，油红O染色，显示2代细胞及3代细胞均有被油红O着色的脂滴形成；运用成骨诱导液诱导分化后，茜素红染色，显示2代细胞及3代细胞均有被茜素红染色的钙盐形成。此研究证明了hUCMSCs的多向分化能力。

2.5 hUCMSCs的优势比较：hUCMSCs具有很强的分化、再生、修复能力，与其他来源的MSCs相比，具有明显的优势[19]，如表1所示。

表1 不同来源间充质干细胞特点比较

3 hUCMSC在烧伤修复与愈合过程中的意义

烧伤的愈合过程是一个复杂而有条不紊的生物学过程，涉及机体内多种细胞、炎性因子、胶原蛋白、促血管生成因子等物质变化，概括起来可分为伤口清理、炎症反应、肉芽组织增生、创面上皮化、瘢痕形成及创面愈合等基本过程。在烧伤创面的愈合过程中，以上过程都呈现出特有的连续性、整体性和一致性，任何一个环节的修复不完善或者不彻底均可引起烧伤创面愈合不良[20-21]。hUCMSCs作为一种具有多向分化潜能和强大旁分泌效应的干细胞，既可以直接提供修复细胞促使损伤创面愈合，加快修复细胞增殖速率，还可以分泌各种抗炎因子、改善细胞因子间的失衡状态来修补损伤创面[22]。总之，hUCMSCs参与了烧伤局部的炎症调节、血管新生、组织修复、结构重塑等各个阶段，从不同方面调控改善烧伤创面局部微环境，促进创面修复愈合，改善机体状况[5,23]。

3.1 炎症反应期：严重烧伤患者机体内单核-巨噬细胞过度活化，不仅能够产生大量炎性介质，导致机体免疫功能紊乱，还能产生大量抗炎介质，抑制机体免疫功能，且极易进一步发展为脓毒症、MODS，甚至死亡，使烧伤的病死率呈现直线上升。hUCMSCs在各种炎性因子的影响下开始被刺激活化，分泌多种抗炎介质，抵抗炎症反应；同时，hUCMSCs还能够对损伤部位的多种免疫细胞发挥直接促进作用，调控这些免疫细胞的表达效应并改变其细胞因子分泌谱，起到抗炎促愈合的作用[24]。hUCMSCs可以表达、合成、分泌生物活性因子，调节代谢、免疫、迁移等组织器官功能。李娜[25]在研究中发现，hUCMSCs可促进M1型促炎巨噬细胞向M2型抗炎巨噬细胞转化，提高M2型抗炎巨噬细胞表面标记物CD206的表达，使促炎因子生成减少，抗炎因子生成增多；hUCMSCs还可通过PGE2、JNK、NF-кB等信号通路调控巨噬细胞的功能，降低炎症反应[26]。此外，Li等[27]的研究表明hUCMSCs可以调控MiR-181c下调TLR4通路从而降低烧伤引起的过度炎症化。由此可见，hUCMSCs在皮肤烧伤愈合过程中可抑制过度炎性反应，减轻炎症反应对组织细胞的损害，减轻烧伤部位皮肤组织的炎性水肿。

3.2 细胞增生期：烧伤发生后24h内，基底细胞便在伤口周围开始聚集、增生、迁移，最终分化成为鳞状上皮，覆盖于肉芽组织表面，保护烧伤创面。同时，新生成的毛细血管穿插于形成的组织中间，为组织修复提供能量、氧气，带走细胞代谢产生的废物，多种免疫细胞也通过新生血管到达炎症部位，促进损伤修复[23,28]。因此，此期涉及鳞状上皮细胞、毛细血管内皮细胞、免疫细胞、基底细胞等多种细胞的增殖、分化、修复过程，而hUCMSCs一方面通过分化成内皮细胞及旁分泌多种血管生成因子，如VEGF和血管生成素1（Ang-1)等促进血管新生；另一方面分泌多种调节蛋白和生长因子严密调控这些细胞的增生，加快烧伤部位皮肤的修复重建，促进烧伤愈合。孙宁[29]等把第4代hUCMSCs细胞悬液经尾静脉注射到裸鼠体内，术后观察其皮肤组织学变化，HE染色显示：炎性因子减少，缺损部位皮肤组织有新生趋势，并有新生腺体产生，表皮细胞表现出多层堆积现象，形成瘢痕组织。

3.3 瘢痕形成及结构重塑期：烧伤后第6天起，瘢痕组织开始生成，其中以网状纤维和胶原纤维为主，还含有少量的纤维细胞结构，使得创缘比较牢固地结合在一起。hUCMSCs既能够促进胶原的沉积而加速创面修复，还可以抑制瘢痕组织的过度生成，避免发生瘢痕疙瘩[30]。Cabrera C等[23]研究表明，hUCMSCs对于生物活性肽的产生、传递、调控具有重要作用，以此来促进创伤面组织修复愈合。另外，hUCMSCs还具有间质细胞特性，间质-上皮间相互影响可不断调节皮肤的稳态和完整性，使烧伤创面的修复与重塑更加安全可靠，更加趋向于正常皮肤组织结构。

4 hUCMSCs在烧伤治疗中的应用

Krause等[31]首次运用雄性小鼠MSCs干预治疗免疫缺陷性小鼠，并取得理想的治疗效果，结果证实MSCs参与了皮肤形成过程及其稳态的维持，为后续临床研究开创先例。同时研究发现，hUCMSCs可在严重烧伤大鼠创面微环境中存活、增殖并发挥创面修复、促进愈合的作用。严重烧伤患者血清中的碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子可以激活Notch信号通路，从而促进 hUCMSCs的存活、增殖及烧伤创面的愈合[32-33]。胡克苏等[34]的研究还发现，hUCMSCs能通过抑制MCP-1及CCX-2的表达而抑制炎性细胞的浸润，减轻炎症反应，降低机体内TNF-α及IL-1的分泌，从而发挥抑制炎症、促进毛细血管新生及烧烫伤创面修复的作用。

程文广等[35]以4周龄SCID小鼠作为实验对象，在小鼠背部中线两侧分别制造Ⅲ度烧伤模型。然后，消化收集第9代hUCMSCs，加入PBS制备细胞悬液，并均匀涂抹到左侧创面(治疗组)，右侧只涂抹PBS(对照组)，最后用油纱覆盖双侧烧伤区域。于处理后7d、14d、28d取小鼠新愈合皮肤组织进行活检，HE染色可发现：hUCMSCs治疗组表皮层明显增厚，表皮嵴数目显著增多，有较多新生细胞、新生血管生成，并且有少许皮肤附属器(如毛囊)形成，效果优于对照组。此研究深入的证明了hUCMSCs对烧伤皮肤的强大修复能力，为临床烧伤的治疗提供新的参考方向。

Liu等[5]以6周龄大鼠为研究对象，采用绿色荧光蛋白标记hUCMSCs，HE染色观察炎性细胞、中性粒细胞、单核-巨噬细胞、胶原纤维、血管等细胞与组织，结果表明，hUCMSCs治疗组可明显降低炎性细胞浸润及IL-1、IL-6、TNF-α的分泌，并有较多新生血管生成；ELISA法检测结果表明hUCMSCs治疗组的抗炎因子、VEGF、I型胶原和III型胶原的比值含量比对照组显著增高，提示hUCMSCs在皮肤出现烧烫伤损害时可以分化成新的修复细胞，抑制炎性因子分泌，促进抗炎介质释放，促进新生血管生成，加快皮肤的修复重建，改善烧伤损害状况[36]。

5 总结和展望

综上所述，临床上烧伤常常并发感染、休克、脓毒血症、MODS等严重并发症，具有很高的病死率。但是，目前临床上常用的清创换药、抗感染、补液、生长因子促进愈合、自身或者异体移植等治疗方法也不能取得完全理想可靠的效果，不能满足患者的需求。而随着组织工程及临床移植医学的兴起和发展，种子细胞的研究也越来越被重视，并取得显著的疗效，hUCMSCs同其他来源的间充质干细胞相比所具有的优点，使之成为研究的新方向、开发的新领域[37]。但hUCMSCs移植的广泛推广运用仍存在许多亟需解决的问题，如在机体内环境的长期作用下，hUCMSCs是否会向肿瘤组织分化，仍有待长期追踪观察、随访研究。相信随着对干细胞深入的研究，分离、纯化、冷藏、扩增分化、表达检测等手段的日益完善，干细胞治疗将会为临床疾病的治疗提供越来越多的帮助，使更多疾病得到治疗甚至治愈，为人类健康带来福利。

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Advances in Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Therapy for Burns

LIU Xuan-kai,ZAHNG Wei
(Institute of Plastic Surgery,Weifang Medical University,Weifang 261041,Shandong,China)

Human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUCMSCs) are a type of newborn umbilical cord cells with significant self-renewal ability and multilineage differentiation capacity. Compared to other original MSCs, the advantages of hUCMSCs are short amplification time, high proliferation rate, lower immunogenicity, higher safety, fewer bioethics issues, abundance, and convenience. It has been reported that hUCMSCs promote the functional recovery of burn patients. Therefore, hUCMSCs are considered as a significant promise for regenerative medicine. In recent years, previous studies have demonstrated that hUCMSCs might create a favorable environment for the treatment of burns, based on the study of basic biological characteristics and its capacity of differentiation. In this review, we summarize the important studies that have investigated the use of hUCMSCs as a therapeutic agent for burns therapy.

umbilical cord mesenchymal stem cells;burns;wound healing

R644

A

1008-6455（2017）05-0134-04

2017-01-18

2017-05-05

编辑/张惠娟

国家自然科学基金(81301647)；山东省自然科学基金（ZR2013HQ025）；山东省高等学校科技计划（J14LL08）；潍坊市科学技术发展计划（201302121）

张伟，女，潍坊医学院整形外科研究所，博士，副教授，硕士生导师；研究方向：基因工程与组织工程；E-mail:zhangwei@wfmc.edu.cn

刘烜凯，男，潍坊医学院整形外科研究所，潍坊医学院在读研究生；研究方向：整形外科；E-mail:1213264178@qq.com