蛋氨酸脑啡肽抑制人胃癌细胞BGC823增殖作用及免疫调节机制

唐佳运， 王晓楠， 李 岩， 单风平*

(1.中国医科大学 基础医学院免疫学教研室，辽宁 沈阳 110122；2.中国医科大学 口腔医学院，辽宁 沈阳 110002)

蛋氨酸脑啡肽抑制人胃癌细胞BGC823增殖作用及免疫调节机制

唐佳运1,2， 王晓楠1， 李 岩1， 单风平1*

(1.中国医科大学 基础医学院免疫学教研室，辽宁 沈阳 110122；2.中国医科大学 口腔医学院，辽宁 沈阳 110002)

采用不同浓度梯度的蛋氨酸脑啡肽(methionine enkephalin，MENK)体外作用于人胃癌细胞BGC823后，探讨对其增殖影响及其作用机制，为胃癌的免疫治疗提供理论依据。体外培养人胃癌细胞株BGC823，PCR检测阿片受体OGFr的表达；用不同浓度(0、1、2、3、4 mg/mL)的MENK体外作用于BGC823细胞24、48、72、96 h后，MTS检测MENK对其增殖影响；流式细胞术和AnnexinV-FITC/PI双染法检测4 mg/mL MENK体外处理48、72 h后BGC823细胞凋亡变化。 结果显示，人胃癌BGC823细胞有阿片受体OGFr的表达；MENK可抑制BGC823细胞增殖，且随着剂量的增加和时间的延长，其抑制作用逐渐增强(P<0.05)；4 mg/mL MENK 48 h处理组与空白组相比细胞凋亡率增加，72 h处理组与48 h处理组结果一致(P<0.05)。结果表明，MENK可抑制BGC823细胞增殖，具有显著的剂量依赖性和时间依赖性，且可通过诱导细胞凋亡抑制BGC823细胞的增殖。

蛋氨酸脑啡肽；阿片受体；BGC823细胞；肿瘤免疫；细胞凋亡

肿瘤是一种细胞异常分化、增殖的疾病，肿瘤发生、发展与肿瘤细胞的过度增殖及凋亡减少密切相关[1]；目前，临床上常用化疗药物多以增殖及凋亡作为作用靶点。胃癌是恶性肿瘤之一，我国死于胃癌的患者在各种恶性肿瘤中占首位[2]。化疗仍是晚期胃癌的主要治疗方法，但是化疗的疗效很难达到预期效果。现有化疗水平已面临瓶颈，生物治疗成为有所突破的必要选择。近年来，免疫疗法成为肿瘤治疗领域的热点，通过激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞，提高抗肿瘤效果[3-4]。随着对胃癌发生、发展和转移过程中生物学机制的研究,也逐步将这种治疗手段应用于胃癌治疗的临床实践。蛋氨酸脑啡肽(methionine-enkephalin，MENK)是一种由5个氨基酸组成的内源性阿片肽，由肾上腺产生的前激素和前脑啡肽衍生而来[5]，非特异性识别细胞、组织与器官，在生理状态下发挥生物学活性，不会使机体产生依赖性、耐受性和撤药反应[6]。已有研究表明，MENK与阿片受体结合，从而对中枢神经系统细胞[7-8]、胸腺细胞、脾细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等一系列免疫细胞起到调节作用[9-10]。MENK的功能主要通过存在于细胞表面的受体,激活其下游的因子和蛋白表达,实现对于靶细胞性状和功能的调节[11]，这说明MENK不仅仅是一种镇痛剂和神经递质，更是一种联系着神经和免疫两大系统且具有调节功能的因子。本课题组前期研究已证实，MENK通过逆转和抑制Treg发挥抗肿瘤作用[12]；通过抑制Treg激活50例肿瘤患者外周血免疫细胞，证明MENK可以高效增加癌症患者外周血T细胞数量和活性，增加NK细胞数量和活性[13]；MENK通过激活CD8+T细胞而充分发挥其抗肿瘤的作用[14]；MENK可增加CD4+T 细胞上阿片受体表达，可直接激活CD4+T细胞，增加CD4+T细胞活性和数量，增加分泌IL-2和IFN-γ，证明MENK不仅可以单独使用，还可以联合其他细胞因子(IL-2或IFN-γ)显著增强CD4+T细胞的功能[15-18]；MENK可以促进DC表型和功能成熟，通过诱导负载肿瘤抗原DC成熟，从而发挥强大的抗肿瘤作用[19-20]；可以诱导肿瘤相关巨噬细胞M2型向M1型转化[21]；可以诱导骨髓DC前体向髓样DC分化[22]。经典阿片受体可分为μ(mu)、δ(delta)、к(kappa)等几种亚型[23]。1989年发现的新受体“zeta”可介导细胞生长，被称为阿片生长因子受体(Opioid Growth Factor Receptor，OGFr)[24]。Zagon等[25]在肿瘤细胞的核膜上发现了OGFr，并采用多种癌细胞系，结果表明MENK通过与其受体结合可抑制肿瘤细胞增殖，进一步用拮抗剂抑制受体表达,或者敲除该受体,肿瘤细胞生长不受限制,说明MENK可通过OGF实现抑瘤效能。Cheng等[26]研究发现OGF受体OGFr相互作用可以抑制胰腺癌细胞的增殖。本课题组前期实验已证实，MENK可抑制黑色毒瘤细胞的增殖。国外有报道，作为一种新型的抗肿瘤药物,MENK已经进入Ⅰ期临床研究阶段。但目前蛋氨酸脑啡肽对胃癌的影响罕见报道，本研究以人胃癌细胞株BGC823为例进行探究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 人胃癌细胞株BGC823由中国医科大学药学院惠赠。

1.1.2 试剂 MENK(含量98%，美国Penta Biotech.)，RT-PCR试剂盒(Takara大连宝生物公司)，琼脂糖(Takara大连宝生物公司)，Trizol(Invitrgen)，RPMI1640培养基(gibico)，标准胎牛血清(天津市灏洋生物制品公司)，Annexin V 试剂盒(B.D.公司)， MTS(promega)。

1.1.3 仪器 微量加样器(美国Thermo)，二氧化碳培养箱(美国 Thermo)，倒置相差显微镜(德国Lieca)，酶联检测仪(美国BIO-TEK)，PCR扩增仪(PTC-200，美国MJ RESEARCH)，流式细胞分析仪(美国BD)，精密电子天平( BS223S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)，超低温冰箱(日本SANYO)，高压蒸汽灭菌器(日本SANYO)，高速台式冷冻离心机 (TGL.20M，长沙湘仪离心机器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将BGC823细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育至对数生长期，每两天更换一次培养液。

1.2.2 RT-PCR法检测SGC-7901细胞中阿片受体OGFr的表达 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液培养BGC823细胞，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以其为模板进行PCR 扩增，反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。引物序列：OGFr基因(NM_007346.2)：上游：5′-TCTGCGAGAACCAGGAGTGAAC-3′，下游：5′-ATCCCGTAGAAGCCCAGCA-3′，扩增产物大小为132 bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3 细胞的活力测定(MTS法) 取对数生长期BGC823细胞，用培养液调整细胞密度为5×104/mL，加入96孔培养板中，每孔100 μL，在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养4 h，待细胞贴壁后进行实验干预。设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、MENK处理(实验对照)组。在96孔培养板中，空白对照组加入100 μL不含细胞的RPMI1640培养液；阴性对照组加入100 μL的RPMI1640培养液；阳性对照组加入100 μL含5 μg/mL 5-Fu的RPMI1640培养液；实验对照组加入100 μL含MENK的RPMI1640培养液，其中MENK处理组设1、2、3、4 mg/mL四个浓度。每个组别设置3个复孔，将96孔培养板置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养24、48、72、96 h。在培养时间结束前的4 h将培养板取出，每孔加20 μL MTS，避光轻轻平摇混匀，再放回培养箱孵育4 h。孵育时间结束后取出，避光处理用酶标仪测定吸光度值(A)，检测波长为500 nm，计算细胞生长抑制率。

抑制率(%)=(((阴性对照组A-空白对照组A)-(实验对照组A-空白对照组A))/(阴性对照组A-空白对照组A))×100%

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞密度为2×104/mL的BGC823细胞悬液1 mL接种于24孔培养板中，培养基补至2 mL，培养24 h后弃掉旧培养基进行试验干预，分成阴性对照组和MENK处理组两组。其中阴性对照组更换成新鲜培养基，MENK处理组加入等体积的含浓度为4 mg/mL MENK的培养液，浓度选择依据MTS结果决定，每组设3个复孔。培养48、72 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，冷PBS漂洗2次(2 000 r/min，5 min)，用1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞密度为1×106/mL，吸取100 μL加入流式管中，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL propidiumIodidec(PI)混匀，室温避光孵育15 min，每管补加400 μL 1×Binding Buffer，1 h内上机检测。

1.2.5 统计学分析 数据用均值±标准差表示，均数间采用t检验，组间采用方差分析。所有的统计学分析利用商品化软件完成(IBM SPSS Statistics 18.0; SPSS Inc., Chicago, IL)，以P<0.05视为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 BGC823细胞阿片受体OGFr的表达

由图1可见，通过RT-PCR显示的结果表明，在132 bp处有一条明显的条带，说明人胃癌细胞BGC823表达OGFr。

图1 OGFr在BGC823细胞中的表达Fig.1 Expression of OGFr on BGC823 cellsM: DNA Marker DL500；1: BGC823

2.2 MENK对BGC823细胞增殖作用的影响

MTS检测结果显示，MENK能够抑制人胃癌细胞BGC823增殖，且随着作用时间的延长和MENK浓度的增加，促进了对细胞的抑制作用，具有显著的时间依赖性和剂量依赖性(P<0.05)，见图2。

2.3 MENK对BGC823细胞凋亡影响

流式细胞术分析显示，4 mg/mL MENK体外作用于BGC823细胞48 h后，与空白对照组(RPMI1640培养液)相比，早期凋亡率和晚期凋亡率总和有所增加(P<0.05)；4 mg/mL MENK体外作用72 h组与其结果一致(P<0.01)，见图3(横坐标代表FITC，纵坐标代表PI)。

图2 MENK对BGC823细胞增殖作用的影响(n=3,%)Fig.2 Effects of MENK on BGC823 cells proliferation(n=3,%)P:5 μg/mL 5-Fu； N：RPMI1640； 1：1 mg/mL MENK； 2：2 mg/mL MENK； 3：3 mg/mL MENK； 4：4 mg/mL MENK；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

图3 MENK对BGC823细胞凋亡影响(n=3,%)Fig.3 Effects of MENK on BGC823 cell apoptosis(n=3,%)

3 讨 论

作为一种重要的内源性阿片肽，MENK已被证实存在于多种动物的组织器官中,为MENK的临床应用提供依据。MENK作为抗癌药物具有以下优点：第一，MENK是内源性阿片肽，作为一种低毒性安全可靠的药物，具有极强的抑制肿瘤细胞增殖的效能，作用效果可逆转。第二，大量研究表明MENK对机体多种细胞功能有调控作用，MENK的抗癌具有广谱性。由于OGFr存在于多种肿瘤细胞中，所以含有OGFr的癌症都会受到MENK的作用。第三，MENK可以调控机体的免疫功能，联合其他药物使用可以修复其他方法导致的机体免疫功能紊乱。

本研究通过PCR检测技术证实胃癌细胞系BGC823表面有OGFr的表达，为证明MENK可能通过结合OGFr抑制肿瘤细胞增殖提供理论基础；MTS检测结果表明，MENK可抑制胃癌细胞BGC823的增殖，且随着MENK剂量的增加和作用时间的延长抑制增殖效果逐渐增强，呈现出显著的剂量依赖性和时间依赖性；为了分析其抑制增殖作用机制，采用流式细胞术检测MENK作用后细胞凋亡变化，发现MENK可通过诱导细胞凋亡来抑制胃癌细胞BGC823的增殖。但MENK诱导凋亡具体作用机制及是否因通过结合OGFr完成这一效应机制还需进一步研究证明。

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MENK to Inhibit the Proliferation of Gastric Cancer Cell Line BGC823 and the Immunomodulatory Mechanism

TANG Jia-yun1, 2, WANG Xiao-nan1, LI Yan1, SHAN Feng-ping1

(1.Teach. &Res.Div.ofImmunol.,Schl.ofBasicMed.Sci.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122; 2.Coll.ofStomatol.Coll.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110002)

The effect of different concentration gradients of methionine enkephalin (MENK) on human gastric cancer cell line BGC823invitrowas investigated its effects on proliferation and its affecting mechanism on gastric cancer, and provided theoretical foundation for gastric cancer immunotherapy. Human gastric cancer cell line BGC823 was cultured in vitro, PCR to detect the expression of opioid growth factor receptor (OGFr), 24, 48, 72, 96 h after different concentrations (0, 1, 2, 3, 4 mg/mL) of MENK were reactedinvitroon BGC823 cells, MTS to determine the effect of MENK on their proliferation. The apoptosis changes was detected 48 h and 72 h after treated with 4 mg/mL MENKinvitroby flow cytometry and Annexin V-FITC/PI double staining BGC823 cells. The results showed that human gastric cancer cell line BGC823 had the expression of OGFr. MENK could inhibit the proliferation of BGC823 cells, and with the increase of dose and the extension of time, the inhibition strengthened gradually (P<0.05). As compared with the blank groups, apoptosis rate of the group treated with 48 h with 4 mg/mL MENK increased, and the result was accord with the one treated 72 h with 4 mg/mL MENK (P<0.05). Therefore, the proliferation of BGC823 cells could be inhibited by MENK, and had significant dose-dependency and time-dependency. In addition, the BGC823 cells proliferation could be inhibited through the induction of cell apoptosis.

MENK; opioid receptor; BGC823 cells; tumor immunology; cell apoptosis

国家自然科学基金项目(31670921)

唐佳运 男，硕士研究生。主要从事肿瘤免疫调节研究。E-mail：188119200@qq.com

* 通讯作者。男，博士，教授，博士生导师。主要从事肿瘤免疫调节研究。E-mail：fpshan@mail.cmu.edu.cn

2017-01-22；

2017-03-29

Q939.91；R73；R392

A

1005-7021(2017)02-0078-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.013