感染HCMV的U251干细胞裸鼠大脑移植瘤模型的建立

高景云， 吕婷婷， 钱冬萌， 胡 明， 王 斌,*

(1.青岛大学医学部 病原生物学教研室，山东 青岛 266071；2.青岛大学医学部 公共卫生学院，山东 青岛 266071)

感染HCMV的U251干细胞裸鼠大脑移植瘤模型的建立

高景云1， 吕婷婷1， 钱冬萌2， 胡 明2， 王 斌1,2*

(1.青岛大学医学部 病原生物学教研室，山东 青岛 266071；2.青岛大学医学部 公共卫生学院，山东 青岛 266071)

研究人巨细胞病毒(HCMV)感染的U251干细胞(GSCS)裸鼠颅内成瘤情况。用单克隆培养法从U251细胞系中分离出GSCS，采用流式细胞仪检测分离出的GSCS中CD133的表达，感染HCMV病毒，制备细胞密度为1×107个/mL的GSCS悬液。取20 只SPF级BALB/c裸鼠腹部麻醉，固定在立体定位仪上，在裸鼠颅脑钻一小孔，将 3 μL干细胞悬液缓慢接种于裸鼠颅内，随机分为HCMV感染组和未感染HCMV组。观察HCMV对肿瘤生长及裸鼠存活情况，处死濒死裸鼠取脑组织做免疫组化检测HCMV感染组胶质瘤内IE蛋白是否持续表达及HCMV感染对胶质瘤干细胞分化为血管的影响。结果显示，经单克隆法分选出的GSCS在无血清培养基中成球生长；经流式细胞仪检测，分离出的GSCS中CD133比例为98.00%；裸鼠脑内出现膨胀性生长的肿瘤；HCMV感染组肿瘤组织中检测到IE高表达，HCMV感染可促进CD133阳性胶质瘤干细胞分化为CD34阳性血管内皮细胞。以上结果表明，HCMV的IE蛋白能在通过此方法建立的HCMV阳性移植瘤中持续表达，且HCMV能促进GSCS分化为血管内皮细胞。

胶质瘤；肿瘤干细胞；裸鼠；HCMV感染

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV) 是双链DNA病毒，属于疱疹病毒β亚科，成年人感染率高达70%～100%[1]，能引起新生儿缺陷及先天性畸形[2]。近十几年来，许多报道在多种肿瘤组织中检测到HCMV基因的表达，其中恶性神经胶质瘤组织中HCMV感染率约90%[3]。神经胶质瘤是临床最常见的原发性脑肿瘤，恶性程度高，大多数呈现浸润性生长，手术治疗不易切除干净，术后复发率高，而且对化疗放疗不敏感，预后普遍较差[4-5]。Singh等[6]研究发现脑肿瘤中几乎所有的细胞均由一小部分CD133阳性细胞产生，即脑肿瘤干细胞 (brain tumor stem cell，BTSC)，这种细胞可能是决定肿瘤发生、发展、转移、复发和对各种治疗敏感性的关键细胞，胶质瘤干细胞理论的提出，为探索HCMV感染与胶质瘤的关系及研发诊疗新技术带来新的突破[5,7]。Cobbs等[3]利用原位双染免疫荧光技术检测恶性胶质瘤组织病理切片，发现CD133+胶质瘤细胞中，HCMV的IE基因的表达率约为60%，因此探讨HCMV感染对胶质瘤干细胞可能的致病机制对胶质瘤的治疗具有重要意义。为此我们建立了BALB/c裸鼠大脑移植瘤模型，为进一步研究HCMV感染与胶质瘤干细胞的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、细胞与裸鼠 PF级BALB/C裸鼠20 只，雄性，4～5 周龄，体质量16～l9 g，购于常州卡文斯实验动物有限责任公司；U251细胞株由本实验室提供；HCMV AD169毒株(MOI值=1)由法国巴斯德实验室惠赠。

1.1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清FBS、DMEM/F12、B27、人表皮细胞生长因子(EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)购自GIBCO公司；兔抗人CD133单克隆一抗、兔抗人CD34一抗、兔抗人IE一抗、羊抗兔二抗、DAB显色液购自博士德生物公司；Alexa Fluor488标记羊抗人IgG和Alexa Fluor610标记羊抗兔IgG二抗购自Molecular Probes公司；颅钻，小鼠脑立体定位仪购自F.S.T公司；流式细胞仪购自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 U251细胞中GSCS的分离与培养 取处于对数生长期的U251细胞用0.25%胰酶消化2 min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后收集于离心管，以1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含B27(20 μL/mL)、EGF(20 ng/mL)、bFGF(20 ng/mL)、LIF(10 ng/mL)的无血清干细胞培养基，制成细胞密度为3×106个/mL的单细胞悬液10 mL，接种于T75细胞培养瓶中，在37 ℃、5% CO2、95%湿度条件下培养。培养方法参照文献[8],10 d后收集第一代细胞球，用Accutase酶消化，以每孔1～2个细胞接种到96孔板中，每孔加入100 μL无血清培养基培养。10 d后收集由1个细胞分裂增殖形成的第2代细胞球，在T75细胞培养瓶中加入无血清培养基继续扩增、传代。

1.2.2 流式细胞仪检测分离出的GSCS中CD133的表达 收集通过单克隆培养法分离出的GSCS，制备细胞密度为1×106个/mL的单细胞悬液。按说明滴加兔抗人CD133一抗(1∶200)孵育30 min，PBS洗3 次，调整细胞密度为1×106个/mL，按说明滴加Alexa Fluor488标记羊抗人IgG(1∶200)和Alexa Fluor610标记羊抗兔IgG二抗(1∶200)，孵育30 min，PBS洗3 次，加缓冲液重悬，在BD流式细胞仪上检测。

1.2.3 HCMV感染GSCS将从U251胶质瘤细胞中分离出的GSCS用Accutase酶消化10 min,用无血清培养基制备密度为1×105个/mL的单细胞悬液置于37 ℃、5% CO2、95%湿度条件下培养24 h，加入HCMV(MOI值=1)轻轻混匀置于恒温培养箱中培养。感染12 h后,1 000 r/min离心5 min去除培养基，细胞通过台盼蓝染色活力大于95%，制备密度为1×107个/mL的单细胞悬液。

1.2.4 裸鼠大脑接种细胞 取20 只SPF级BALB/c裸鼠，4～6 周龄，称重，随机分为HCMV感染GSCS组(A组)和GSCS对照组(B组)，用质量分数为10%的水合氯醛腹腔麻醉裸鼠，麻醉剂量为200 mg/kg体重。将裸鼠固定在小鼠脑立体定位仪上，用碘伏消毒头部皮肤，在头部正中剪开0.5 cm长皮肤，暴露颅骨，用眼科镊剥离骨膜，用小型颅钻在冠状缝前1.5 mm、矢状缝右侧2.0 mm处钻一小孔，用5 μL微量注射器吸入3 μL事先准备好的GSCS悬液固定到立体定位仪上，操作仪器使注射器针头由裸鼠脑钻孔处下降4 mm，退针1 mm，注射时间5 min，留针2 min，骨蜡封闭钻孔，缝合皮肤。

1.2.5 荷瘤鼠生长情况及肿瘤干细胞增殖分化指标观察 观察荷瘤鼠精神状态、活动情况、神经症状、饮食进水及存活时间。记录裸鼠接种后死亡时间，留取脑组织进行HE染色病理检查。免疫组织化学检查颅内肿瘤CD133、IE、CD34的表达。

1.2.6 肿瘤组织HE染色 裸鼠死后，取出脑组织用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常规脱水石蜡包埋，切片厚10 μm，二甲苯脱蜡2次×5 min，无水乙醇3次×5 min，双蒸水洗2次×5 min(吸干水)，苏木精染色10 min，双蒸水洗3 min(吸干水)，0.5%盐酸乙醇分化30 s，自来水冲洗返蓝(吸干水)，伊红10 s，常规脱水，透明封片，显微镜下观察。

1.2.7 免疫组化检测肿瘤组织中CD133、IE、CD34

表达 脑组织切片厚10 μm，常规脱蜡水化，在30%H2O2室温浸泡10 min封闭内源性过氧化物酶，双蒸水洗2次×3 min，微波修复抗原，5%山羊血清室温封闭30 min，加入抗CD133(1∶500)、CD34(1∶200)和IE(1∶500)4 ℃孵育过夜，37 ℃复温45 min，PBS洗3次×5 min,滴加二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗3次×5 min，擦干水滴加DAB显色液，自来水冲洗，苏木精复染30 s，自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯浸泡20 min，中性树脂封片，显微镜下观察。CD34切片进行微血管密度(MVD)计数。

2 结果与分析

2.1 单克隆培养法分离的GSCS悬浮成球生长

处于对数生长期的U251胶质瘤细胞(图1A)在无血清干细胞培养基中培养5 d后可见几十个大小不一的半悬浮细胞球，10 d后细胞球体积增大，形成第1代肿瘤干细胞球(图1B)，将第1代肿瘤干细胞球制成单细胞悬液，通过单克隆培养法分离培养10 d后形成第二代肿瘤干细胞球(图1C) 。

图1 U251细胞在不同培养条件下的生长状态Fig.1 The U251 cell physiological status in different culture conditions

2.2 流式细胞仪检测GSCS中CD133表达

流式细胞仪检测结果显示，用单克隆培养法在无血清培养基中分离出的胶质瘤干细胞高表达干细胞标记物CD133，CD133阳性细胞数比例为98.00%(图2)。

2.3 裸鼠生长观察及肿瘤生长情况

HCMV感染组10 只，麻醉致死1 只，致瘤率为100%。接种后12 h恢复正常觅食饮水活动，在肿瘤移植后的前2 周，荷瘤鼠的活动、进食、饮水均正常，无死亡现象。至第3 周开始出现活动减少、进食减少、身体消瘦、皮肤皱褶严重，双眼凸起，但均未见明显的神经症状，平均生存期为(29.5±1.2) d。肉眼观察可见，肿瘤在裸鼠脑内生长，未穿透脑膜，但可见右侧大脑膨胀性向对侧生长，矢状缝向对侧偏离(图3A)，HE染色高倍镜下观察显示肿瘤细胞核变大，核异形，出现多核，异常分裂象(图3B)；未感染HCMV组10 只，接种GSCS细胞，致瘤率100%，晚期表现与HCMV感染组相似，平均生存期为(32.2±2.7) d。Kaplan-Meier生存分析显示HCMV感染组和HCMV未感染组存活率差异具有统计学意义(P<

0.05)，见表1。

图2 用流式细胞仪检测单克隆培养法分离出的GSCS中CD133的比例Fig.2 Use flow cytometry to detect the expression of CD133 in the GSCS which was selected by monoclonal culture method

图3 移植瘤生长情况Fig.3 The growth situation of transplanted tumor

表1 两组裸鼠存活率比较±s，d)

注：两组比较P<0.05，具有统计学意义，下表同

2.4 免疫组化检测肿瘤组织中IE、CD34表达

HCMV感染组荷瘤鼠脑肿瘤组织通过免疫组化方法检测到HCMV的IE蛋白高表达(图4A)，胶质瘤干细胞可分化为表达CD34的血管内皮细胞(图4B), HCMV感染组MVD值计数高于未感染HCMV组(P<0.05),见表2。

图4 移植瘤中IE、CD34表达Fig.4 Expressions of IE,CD34 in transplanted tumor

表2 两组裸鼠颅内移植瘤MVD计数的比较±s)

3 讨 论

巨细胞病毒感染遍布全球，是一种传播范围广泛的疱疹病毒，在我国成年人血清中HCMV抗体阳性率接近100%，HCMV感染率极高，但是关于HCMV感染与肿瘤发生的关系仍然存在争议，HCMV感染诱导肿瘤发生的机制至今尚不清楚。近年来，关于HCMV感染与肿瘤相关的研究越来越多，许多研究发现在肿瘤组织中检测到HCMV基因的表达。因此,在研究肿瘤的发生发展机制及治疗时有必要把HCMV感染这一重要因素考虑在内，虽然HCMV不是致瘤病毒，但当肿瘤发生后HCMV可以协同肿瘤发展、迁移。本研究建立了感染HCMV的脑肿瘤干细胞裸鼠移植瘤模型，初步探讨了HCMV感染肿瘤干细胞的方法。进一步的研究将从体内血清HCMV抗体阳性的脑胶质瘤患者肿瘤组织中取原代细胞培养，分离出脑肿瘤干细胞，建立HCMV阳性的胶质瘤干细胞裸鼠大脑移植瘤模型。

胶质瘤是人类最常见的原发性恶性脑肿瘤，发病率呈逐年递增趋势，其恶性程度高、多呈浸润生长，治疗困难，手术后复发率高。由于胶质瘤中含有一小部分表达干细胞标记的细胞(肿瘤干细胞)，这些肿瘤干细胞数量虽然很少，却在肿瘤治疗中起关键作用。研究胶质瘤首先应研究胶质瘤干细胞特性，将有助于指导临床对胶质瘤的治疗及预后评估。本研究采用单克隆法从U251细胞系中成功分离出悬浮生长的细胞球，结果与Singh等[6]和Clarke等[9]结果相符。分离出的肿瘤细胞球高表达CD133，证明了U251细胞系中存在脑肿瘤干细胞。其他分离胶质瘤干细胞的方法有流式细胞分选法和免疫磁珠法等，这些方法均能分离出高纯度的肿瘤干细胞。但由于细胞系中肿瘤干细胞含量很少，用流式细胞分选和免疫磁珠分选法分离出尽可能多的肿瘤干细胞至少从第一代肿瘤细胞球中分选。CD133阳性胶质瘤干细胞具有很强的增殖分化能力。有学者认为，肿瘤的致瘤性可能由数量很少的一部分肿瘤干细胞决定[10-11]。本研究发现HCMV感染促进胶质瘤干细胞分化为血管内皮细胞，这一现象与Maussang等[12]研究结果相符。HCMV感染促进肿瘤生长，增加了肿瘤恶性程度。本研究建立的HCMV阳性胶质瘤干细胞裸鼠原位移植瘤模型，为研究胶质瘤的化疗新药物提供了参考。

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Establishment of an Orthotopic Transplant Brain Glioma Model of U251 GSCSwith HCMV Infection in Nude Mice

GAO Jing-yun1, LYU Ting-ting1, QIAN Dong-meng2, HU Ming2, WANG Bin1,2

(1.Teach. &Res.Div.ofPathol.Bio1.,Med.Col1., 2.Coll.ofPub.Health,QingdaoUni.,Qingdao266071)

Intracranial tumor formation in nude mice U251 glioma stem cells (GSCS) after infected with HCMV was studied. GSCSwere isolated from U251 cell line by monoclonal culture method. The expression of CD133 in isolated GSCSwas detected by flow cytometry and infected to HCMV to prepare GSCSsuspension at 1×107cells/mL. Took twenty BALB/c nude mice of SPF class and anesthetized in belly, and fixed them on stereotaxis instrument, and then drilled a small hole on their cranial bone, slowly injected with 3 μL stem cell suspension intracranially, the mice were randomly divided into HCMV infection group and non-infected group. The tumor formation by HCMV and the survival of nude mice were observed, and killed those dying mice and took their brains tissues for immunohistochemical detection whether IE protein expression persists in the tumor of HCMV infection group and how HCMV affects GSCSdifferentiated into CD34 positive vascular endothelial cells. The results showed that using monoclonal culture method can isolate Glioma stem cells; the ratio of CD133 positive cells in GSCSwas 98.00%; Mass tumors appeared in mice brain; In HCMV infection group, tumors highly expressed IE and HCMV can promote CD133+GSCSdifferentiated into CD34 positive expression vascular endothelial cells. It is concluded that the orthotopic implantation tumor model established by this method can continuously express HCMV IE protein and HCMV infection can promote GSCSdifferentiated into vascular endothelial cells.

glioma; GSCS; nude mice; HCMV infection

国家自然科学基金项目(81471958)；山东省“病原生物学”泰山学者工程资助项目

高景云 男，硕士研究生。研究方向为HCMV感染对胶质瘤干细胞分化增殖的影响。E-mail:gaozhiyang.ok@163.com

2016-07-05；

2016-08-29

Q939.9；R73

A

1005-7021(2017)02-0073-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.012

* 通讯作者。男，博士，教授，博士生导师。主要研究方向为病毒基因工程与分子制药。

Tel:0532-83780032,E-mail:wangbin31@yahoo.com