虾源哈维氏弧菌的致病性与生物学特性比较分析

刘 迪，房文红，周红霞，王 元，陈甜甜，李 健，周俊芳

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306； 3.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025)

虾源哈维氏弧菌的致病性与生物学特性比较分析

刘 迪1，2，房文红1，周红霞3，王 元1，陈甜甜1，2，李 健1，2，周俊芳1

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306； 3.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025)

哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)是导致养殖对虾暴发弧菌病的重要病原之一。从我国南方养殖凡纳滨对虾(Penaeusvannamei)分离、鉴定了10株哈维氏弧菌(Vh00947、Vh00949、Vh11011、Vh11014、Vh21217、Vh21218、Vh21220、Vh21229、Vh21231和Vh31487)，分别肌注感染健康凡纳滨对虾后发现，菌株Vh21229致病性很弱，Vh00949其次，其它菌株毒力较强；对8种哈维氏弧菌常见毒力基因(Vh1、Vh2、Vh3、Vh4、toxS、hcp、zot和pap6)的检测显示，南方虾源哈维氏弧菌无论强弱毒株都很少携带zot、pap6、toxs和4种Vh基因(≤10%)，表明这10个菌株的致病性与这7种常见毒力因子的相关度很低；hcp基因在所有菌株中均有检出，其中强毒株中检出率较高(50%)，在较弱毒株(Vh00949)中也存在，表明hcp基因与这些菌株的致病性密切相关，但不是决定性因子。因此，这10株南方虾源哈维氏弧菌菌株的致病性差异应由这8种常见毒力因子以外的未知或未检测到的因子所决定。生化特征分析显示，所有菌株中只有弱毒株Vh21229不能利用D-甘露糖、蔗糖、D-海藻糖，而且只有其赖氨酸脱羧酶反应至阳性，而其它菌株均为阴性，推测导致哈维氏弧菌菌株生化特性改变的某种因子可能对菌株的致病性也产生了影响。药敏实验表明，10株哈维氏弧菌均对环丙沙星、氯霉素、恩诺沙星、美罗培南、头孢曲松、多西环素、头孢吡肟、诺氟沙星敏感，而对氨苄西林耐受性强，表明在虾类养殖过程中应当严格规范和控制抗菌药物尤其是青霉素类药物的使用。

哈维氏弧菌； 致病性； 毒力基因； 药敏实验； 生化特征

弧菌病是海水动物养殖中危害最为严重的病害之一[1]。随着海水养殖业的发展，该病呈现传播速度快、病程短的趋势。哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)是导致养殖动物暴发弧菌病的重要病原之一[2]。作为养殖环境中的常见菌，哈维氏弧菌广泛分布于养殖海水及水产动物体内外[3]，并在水温高于20 ℃时大量繁殖。哈维氏弧菌宿主范围广泛，能够感染多种海洋脊椎动物和无脊椎动物[4]，如大黄鱼(Larimichthyscroceus)、海鲷(Sparusaurata)、尖吻鲈(Latescalcarifer)等海水鱼类、甲壳类动物以及贝类动物[5-9]。

暴发哈维氏弧菌病的动物，其主要症状因宿主种类和其自身的健康状况而略有差异，如哈维氏弧菌可导致网箱养殖大黄鱼“烂尾病”[9]、高体鰤(Serioladumerili)“体表溃疡病”[10]和遮目鱼(Chanoschanos)等多种鱼的“眼病”[11]等。对于甲壳类动物，哈维氏弧菌常感染中国明对虾(Penaeuschinensis)、凡纳滨白对虾(P.vannamei)和日本囊对虾(P.japonicus)的苗期个体和幼体，成体也可感染而暴发弧菌病，且发病虾死亡率很高[12-13]，但是，本实验室在前期研究中发现[2]，同为凡纳滨对虾源的哈维氏弧菌分离株，毒性差异可能很大。为了进一步探索哈维氏弧菌的毒力形成机制，本研究从凡纳滨对虾中分离了10株哈维氏弧菌，对这些菌株的常见毒力基因和致病性以及一般生物学特性开展了对比研究，以期为进一步探索哈维氏弧菌的致病机制和哈维氏弧菌病的防治方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离和培养

10株哈维氏弧菌菌株于2009～2015年分离自海南、福建、浙江和上海等省市养殖凡纳滨对虾。无菌挑取对虾肌肉、肝胰腺组织涂抹到TCBS培养基29 ℃培养24 h后，挑取单菌落在2216E海水培养基(海博)上纯化，最后接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB + 2% NaCl)中，29 ℃振荡培养18～24 h，用于分子鉴定。

1.2 16S rRNA基因序列测定和分析

1.2.1 细菌DNA提取

取1 mL TSB细菌培养液，按“细菌基因组提取试剂盒”的说明(天根)操作，制备的细菌基因组总DNA用作PCR模板。

1.2.2 16S rRNA基因序列的PCR扩增与测序

扩增16S rRNA基因的引物为：正向27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′和反向1492R：5′-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′[14]。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环30次；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物直接交由上海生物工程技术公司进行序列测定，测得的序列经BLAST程序比对，确认菌株种类。

1.3 人工感染实验

健康凡纳滨对虾购自海南琼海对虾养殖企业，体质量为(10±0.7) g。将上述分离、鉴定的哈维氏弧菌菌株分别接种于TSB肉汤(TSB + 2% NaCl)培养，29 ℃培养24 h后，取1 mL菌液用PBS(0.1 M，pH 7.4)作10倍比梯度稀释(101～109)。根据弧菌生长状况，每株菌取3个稀释度的菌液涂布2216E平板培养，采用平板计数法计数，同时另取3个稀释度的菌液从腹侧肌肉注射健康凡纳滨对虾，每个梯度攻毒24 ind对虾，注射量为50 μL·ind-1，对照组注射等量PBS(0.1 M，pH 7.4)，分别暂养于4个条件相同、水温控制在(29±1) ℃的120 L玻纤桶中，观察1周，记录各组对虾的发病和死亡情况。

1.4 药敏实验

采用文献[15-17]描述的微量肉汤稀释法测定分离哈维氏弧菌对16种常用抗菌药物(表1)的敏感性。以大肠杆菌ATCC25922 作为质控菌株，并设置阳性(无抗生素菌液)和阴性(MH肉汤)对照，将无菌生长的最低药物浓度视为最小抑菌浓度(MIC)。

1.5 生化特性鉴定

上述哈维氏弧菌首先经革兰氏染色鉴定，确定全部为革兰氏阴性(G-)，然后采用生物梅里埃ATB自动细菌鉴定仪和G-细菌鉴定卡进行鉴定。10株哈维氏弧菌经28 ℃培养18 h后，将调好密度的菌液按说明书上的方法分别加入到试剂条内，28 ℃孵育过夜后，在细菌鉴定仪上读取鉴定结果。

1.6 毒力相关基因检测

[18-20]，采用分子生物学方法检测了上述哈维氏弧菌的常见毒力相关基因，包括哈维氏弧菌溶血素基因(Vh1、Vh2、Vh3和Vh4)、弧菌毒力调控基因(toxS)以及其它弧菌毒力相关基因(hcp、zot和pap6)。

2 结果与分析

2.1 哈维氏弧菌分离和鉴定

细菌培养后，在TCBS上形成黄色和绿色两种菌落，在2216E上全部为圆形、光滑、湿润、边缘整齐的乳白色菌落。所有纯化菌落，经16S rRNA基因测定并测序分析后，分别鉴定为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌等。根据测序结果，对获得的10株哈维氏弧菌菌株(Vh00947、Vh00949、Vh11011、Vh11014、Vh21217、Vh21218、Vh21220、Vh21229、Vh21231和Vh31487)分别进行致病性分析。

2.2 哈维氏弧菌分离株的致病性

哈维氏弧菌感染健康凡纳滨对虾后，观察期内，感染组对虾出现不同程度的红体和死亡现象，而对照组对虾摄食良好，没有出现发病特征。以观察期内感染组对虾出现半数死亡所需感染菌的最小数量为判定标准，把10株哈维氏弧菌分为强弱致病菌株，如表2所示。从表2中可以看出，哈维氏弧菌菌株Vh00947、Vh11011、Vh21217、Vh21220、Vh21231和Vh31487的致病性很强，攻毒弧菌数小于1 000 cfu·ind-1即可导致观察期内被感染对虾死亡50% 以上(LD50≤1×103cfu·ind-1)；菌株Vh11014和Vh21218致病性较强，攻毒弧菌数小于10 000 cfu·ind-1可导致观察期内被感染对虾死亡50%以上(1×1031×105cfu·ind-1)最弱。

表1 抗菌药物及其MIC判定折点Tab.1 Antimicrobials and their breakpoints for MIC (μg·mL-1 )

注: *: 环丙沙星、头孢吡肟、美罗培南、庆大霉素和氨苄西林的MIC阐释标准参考CLSI(2010)中关于弧菌属药物敏感性的判定标准[16]，多西环素、氯霉素、土霉素和磺胺甲噁唑参考霍乱弧菌的药敏判定标准[16]；氟苯尼考和恩诺沙星参考兽医版本肠杆菌科的药敏判定标准CLSI(2008)[15]；红霉素和利福平参考CLSI(2008)中肠球菌的判定标准[15]；诺氟沙星、头孢曲松和硫酸新霉素是CLSI(2014)中气单胞菌的判定标准[17]；-：无对应的参考标准

Note: *:MICbreakpoints for ciprofloxacin, cefepime, meropenem, gentamicin, amplicillin, doxycycline, chloramphenicol, oxytetracycline and sulfamethoxazole are described by CLSI (2010)[16], and the breakpoints for the latter four agents are usually used forV．choleraonly, breakpoints for florfenicol and Enrofloxacin refers to the CLSI (2008)[15]used for Enterobacteriaceae, breakpoints for erythromycin and rifampicin are recommended by CLSI (2008) used forEnterococcussp.[15], breakpoints for Norfloxacin, Ceftriaxone and Neomycin Sulphate refers to the CLSI (2014) used forAeromonassp.[17], -: No criteria available

表2 10株哈维氏弧菌分离株的致病性Tab.2 Pathogenicity degree of the 10 V. harveyi isolates

注：+++：感染菌数小于1×103cfu·ind-1；++：感染菌数小于1×104cfu·ind-1；+：感染菌数小于1×105cfu·ind-1；±：感染菌数大于1×105cfu·ind-1

Note:+++: infectious bacteria number ≤1×103cfu·ind-1， ++: infectious bacteria number≤1×104cfu·ind-1， +: infectious bacteria number≤1×105cfu·ind-1， ±infectious bacteria number: >1×105cfu·ind-1

2.3 药物敏感性

10株哈维氏弧菌的药物敏感性如表3所示，10株菌对不同药物的敏感程度存在较大差异。所有分离菌株都对环丙沙星、氯霉素、恩诺沙星、美罗培南、头孢曲松、多西环素、头孢吡肟、诺氟沙星敏感，而对氨苄西林严重耐受，对其它药物如硫酸新霉素、利福平、氟苯尼考、土霉素、庆大霉素和磺胺甲恶唑的敏感情况差异较大。

2.4 生化特性

10株哈维氏弧菌菌株的生化特性见表4。从表4可以看出，在48项G-菌鉴定项目中，所有的菌都反应为阳性的项目为丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、D-葡萄糖和L-脯氨酸芳胺酶3种，而反应为阴性的项目有侧金盏花醇、L-阿拉伯醇、D-纤维二糖、H2S产生、谷氨酰芳胺酶、γ-谷氨酰转移酶、D-甘露醇、β-木糖苷酶、β-丙胺酸芳胺酶、脂酶、古老糖、尿素酶、D-塔格糖、柠檬酸盐(钠)、丙二酸盐、5-酮-葡萄糖苷、乳酸盐产减、α-葡萄糖、琥珀酸盐产减、N-乙酰-β-半乳糖氨酶、α-半乳糖苷酶、氨基乙酸芳胺酶、鸟氨酸脱羧酶、脱羧酶阴性控制、组氨酸同化、β-葡萄糖苷酸酶等26项，而且所有菌都表现为O/129敏感，符合弧菌的特征；其它鉴定项目如吡咯烷基芳胺酶、β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰葡萄糖苷酶、葡萄糖发酵、β-葡萄糖苷酶、D-麦芽糖、D-甘露糖、酪氨酸芳胺酶、D-山梨醇、蔗糖、D-海藻糖、磷酸酶、赖氨酸脱羧酶、COURMARATE、谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶、L-苹果酸盐同化、ELLMAN和L-乳酸盐同化等项目的反应则有所不同，表现了各自特有的生化特征。

表3 16种抗菌药物对不同哈维氏弧菌菌株的MIC值Tab.3 MIC values of 16 antimicrobial agents to the 10 V. harveyi isolates

表4 10株哈维氏弧菌的生化特征Tab.4 Biochemical characteristics of the 10 V. harveyi isolates

注：+：阳性；-：阴性；(+)：可疑阳性；(-)：可疑阴性

Note: +: Positive; -: Negative; (+): Doubtfully positive; (-): Doubtfully negative

2.5 毒力基因检测

为了探究菌株毒力与常见毒力因子的相关性，本研究对该10株哈维氏弧菌菌株常见毒力基因的携带情况进行了PCR检测，结果如表5所示：hcp基因总检出率和强毒株中检出率最高，均为50%，但是，该基因也出现在较弱毒株Vh00949中；Vh1、zot和pap6基因的总检出率较低，均为10%；toxS、Vh2、Vh3和Vh4基因在所有菌株中均未检测到。

表5 8种毒力因子的检出率Tab.5 Detection rates of 8 virulence genes carried by the 10 V. harveyi isolates

3 讨论

哈维氏弧菌呈世界范围分布，广泛分布于近海岸水环境，也是部分水生脊椎动物和无脊椎动物肠道中正常存在的菌群，主要存在于海洋动物体表、鳃和肠道等组织器官[21]。尽管哈维氏弧菌是一种条件致病菌，但是，近几年的研究表明，哈维氏弧菌是许多水产动物的原发病原[2]，可导致鱼、虾、贝类等在育苗和养殖过程中暴发疾病甚至大量死亡，经济损失严重[5, 21]。

本研究从养殖凡纳滨对虾分离了10株哈维氏弧菌，从致病性研究可知，同为凡纳滨对虾来源的不同哈维氏弧菌菌株的致病性存在很大差异：Vh21229致病性很弱，Vh00949其次，其它菌株的毒力均很强。SAEED[22]研究认为，这种致病性的强弱差异主要是由弧菌的某种或某些可遗传的毒力因子决定的。LIU等[23]的研究也表明，哈维氏弧菌分泌的毒力因子胞外蛋白酶、磷脂酶或溶血素可能对斑节对虾(Penaeusmonodon)的致病性起重要作用。由于对哈维氏弧菌病认识较晚，对其毒力因子和致病机制的研究尚不够充分，已有研究显示[21]，哈维氏弧菌的毒力因子主要有毒力因子表达调控类、溶血素类、共调蛋白类、粘附毒素类以及蛋白酶类等。为了初步探索毒力因子与菌株致病性强弱的关联性，本研究检测了哈维氏弧菌常见的8种毒力因子基因，即毒力表达调控基因(toxS)、溶血素基因(Vh1、Vh2、Vh3、Vh4)、溶血素共调蛋白基因(hcp)、小带粘附毒素基因(zot)和金属蛋白酶基因(pap6)。结果发现，我国南方地区的哈维氏弧菌无论强弱毒株都很少携带zot、pap6、toxS和4种Vh基因，表明这些虾源哈维氏弧菌菌株的致病性与这7种常见毒力因子的相关度很低；hcp基因的总检出率和在强毒株中的检出率都维持在50%，表明hcp基因与南方虾源哈维氏弧菌的致病性密切相关。研究认为[24]，hcp基因主要在粘附因子基因的表达、体外细胞系有效的粘附定植、抗吞噬作用及生物被膜形成中扮演重要的角色。但是，由于hcp在强毒株中的检出率不到100%，而且在较弱毒株(Vh00949)中也存在，表明这些虾源哈维氏弧菌菌株的致病性差异应由这8种常见毒力因子以外的未知或未检测的因子所决定。随后的生化特征分析显示，所有菌株中只有弱毒株Vh21229不能利用D-甘露糖、蔗糖、D-海藻糖，而且只有其赖氨酸脱羧酶反应阳性，而其它菌株均为阴性，推测导致哈维氏弧菌菌株生化特性改变的某种因子可能对菌株的致病性也产生了影响。此外，在生产实践中，感染动物的发病程度除了与菌株毒力相关外，还与菌株的耐药种类和耐药程度密切相关[25]，后者决定了防治措施的有效性。本研究中10株哈维氏弧菌分离株药敏谱差异较大，但是，都对环丙沙星等喹诺酮类、头孢曲松等头孢类和氯霉素等酰胺醇类敏感，而对氨苄青霉素严重耐受。由于菌株耐药现象与药物使用方法和耐药基因的产生关系密切[26]，因此，在虾类养殖过程中应当严格规范和控制抗菌药物尤其是青霉素类药物的使用，遏制耐药基因的产生与扩散，从而确保疾病有效防治。

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A comparative study on pathogenicity and biochemical characteristics ofVibrioharveyistrains isolated fromPenaeusvannamei

LIU Di1,2, FANG Wen-hong1, ZHOU Hong-xia3, WANG Yuan2, CHEN Tian-tian1,2, LI Jian1,2, ZHOU Jun-fang1

(1.KeyLaboratoryofEastChinaSeaandOceanicFisheryResourcesExploitationandUtilization,MinistryofAgriculture,EastChinaseaFisheriesResearchInstitute,ChinaAcademyofFisherySciences,Shanghai200090,China; 2.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China; 3.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China)

Vibrioharveyiis one of the major pathogens responsible for the shrimp vibriosis. In this study, 10 V.harveyi strains (Vh00947, Vh00949, Vh11011, Vh11014, Vh21217, Vh21218, Vh21220, Vh21229, Vh21231 and Vh31487) were isolated fromPenaeusvannameiin southern China and identified. The animal infection experiment showed that all the strains were virulent toP.vannameiexcept Vh21229 and Vh00949. The detection of 8 common virulence genes ofV.harveyi(Vh1,Vh2,Vh3,Vh4,toxS,hcp,zotandpap6) showed that these southern China shrimp-derivedV.harveyistrains, whether virulent or lentogenic, rarely carried zot, pap6 and 4Vhvirulence genes (≤ 10%), indicating that the pathogenicity of these 10 strains was in low relation to the 7 common virulence genes. The hcp gene was found in both virulent and lentogenic strains, suggesting that hcp gene is closely related to the pathogenicity of the 10 strains, but not the decisive factor and the pathogenicity of 10 strains was decided by some unknown or undetected factors other than the 8 common virulence factors. The biochemical characteristics analysis showed that in the 10 strains, Vh21229 strain was the only one that was negative for D-mannose, sucrose and D-trehalose while positive for lysine decarboxylase. So it is speculated that the factors altering the biochemical charcteristics ofV.harveyialso alter its pathogericity. The drug susceptibility test showed that all the 10 strains were susceptible to ciprofloxacin, chloramphenicol, enrofloxacin, meropenem, ceftriaxone, doxycycline, cefepime and norfloxacin but highly resistant to ampicillin, suggesting that the antimicrobial agents, especially penicillins, should be strictly controlled during the shrimp farming.

Vibrioharveyi; pathogenicity; virulence genes; antimicrobial susceptibilitytest; biochemical characteristics

1004-2490(2017)02-0197-09

2016-03-29

上海市自然科学基金(12ZR1436700)；公益性行业(农业)科研专项基金(No.201303047);上海市虾类产业技术体系建设项目[沪农科产字(2014)第5号]

刘 迪(1990-)，女，硕士研究生，主要从事水产动物病害学研究。

周俊芳，副研究员。 Tel: 021-65699301，E-mail: zhoujf@ecsf.ac.cn

Q 93-331

A