0#柴油和东海平湖原油对黑鲷血细胞DNA损伤的研究

董 冉，沈新强，蒋 玫，李 磊，杨杰青，许高鹏

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090； 2.上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306)

0#柴油和东海平湖原油对黑鲷血细胞DNA损伤的研究

董 冉1,2，沈新强1，蒋 玫1，李 磊1，杨杰青1,2，许高鹏1,2

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090； 2.上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306)

采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)，以砂滤过的清洁海水为对照组，研究0#柴油(0.015 mg·L-1、0.03 mg·L-1、0.06mg·L-1)和东海平湖原油(0.03 mg·L-1、0.06 mg·L-1、0.12 mg·L-1)在不同暴露时间(3 d、7 d、15 d和21 d)对黑鲷血细胞核DNA损伤作用。结果显示，黑鲷血细胞DNA损伤程度与两种石油有显著的剂量-效应和时间-效应关系。实验第3天，0#柴油和东海平湖原油试验组就检测到DNA损伤，主要以1级损伤为主。随0#柴油和平湖原油浓度的增高和胁迫时间的延长，彗尾DNA相对含量(Tail DNA%)和彗尾长度/核直径(TL/D)值均呈上升趋势，DNA损伤级别逐渐升高。恢复实验结束后，中、高浓度组0#柴油(0.03 mg·L-1、0.06 mg·L-1)和平湖原油(0.06 mg·L-1、0.12 mg·L-1)的彗尾DNA相对含量(Tail DNA%)和彗尾长度/核直径(TL/D)值无法恢复至对照组水平(P<0.05)。从DNA损伤程度来推测，0#柴油的生物毒性大于平湖原油。研究表明，鱼类血细胞DNA损伤可作为监测海洋石油污染的生物标志物。

0#柴油； 平湖原油； 黑鲷； DNA损伤； 彗星实验

近年来，以海洋溢油为主的海洋污染日趋严重，石油污染不仅可以影响受污染海域的整个海洋生态系统，破坏其生态平衡，导致海洋生物数量减少乃至灭绝[1-2]。目前有关石油污染的研究主要集中在其对海洋生物抗氧化酶活性影响等方面，陈荣等[3]、余群等[4]的研究显示0#柴油会对僧帽牡蛎(Ostreacucullata)和真鲷(Pagrosomusmajor)的抗氧化酶系统产生影响，董冉等[5]发现0#柴油和平湖原油能引起黑鲷(Sparusmicrocephalus)肝脏、鳃和肌肉中不同种类抗氧化酶活性变化，李磊等[6]发现石油不仅影响黑鲷肝脏中7-乙氧基异吩噁唑酮-脱乙基酶(ethoxyresorufin-O-deethylase，EROD)活性，还影响黑鲷的CYP1A1mRNA表达。近年来，越来越多国内外学者把研究重点放在分子遗传学改变方面，如DNA初级损伤、基因异常表达等。 HAMOUTENE等[7]研究了石油烃对蛤蜊(Myaarenaria)和紫贻贝(Mytilusedulis)的DNA损伤效应，结果表明与重油相比，轻质油对两种生物血淋巴细胞和消化腺细胞造成DNA损伤程度更为严重。金春华等[8]发现，大弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris)血细胞DNA 的损伤程度和镉污染胁迫之间同时存在时间-效应和剂量-效应关系。TABAN等[9]在分散原油对海胆(Strongylocentrotusdroebachiensis)和贻贝(MytilusedulisL.)的DNA损伤研究中也指出，DNA损伤可以作为分子生态毒理学指标。但目前针对不同种类的石油对海洋鱼类DNA损伤的对比研究还较为少见。

水污染遗传毒性监测中最常用的技术是单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)，又称彗星实验(comet assay)，该技术较以往的传统方法更为稳定、灵活性更高、应用也更为简便[10-11]。

本研究以黑鲷为目标生物，通过彗星实验探究了0#柴油和平湖原油对黑鲷血细胞DNA的损伤效应，探讨其作为石油烃污染生物标志物的可行性，从而为溢油污染的毒性机理研究提供科学参考，进一步为石油污染的监测和海洋渔业资源的保护提供基础资料。

1 材料与方法

实验用油为市售0#柴油，原油产自平湖油气田。实验海水为经过滤的天然海水，盐度21～22，pH 8.20，经沉淀和砂滤后，充分曝气24 h以上备用。受试黑鲷由江苏省海洋水产研究所提供，实验前驯养一周，状态稳定后选取的健康个体进行实验，体重平均为(6.75±1.15) g。

将0#柴油和东海平湖原油分别与过滤海水按1∶10(V∶V)配比，置于磁力搅拌机上，连续高速搅拌24 h后静置3 h分离出水相，作为实验用的0#柴油和东海平湖原油水溶分母液(water soluble fraction，WSF)，注入棕色母液贮瓶中，4 ℃冰箱保存2～3 h[12]。使用紫外分光光度计法测定石油烃的含量[13]。

1.1 实验方法

选用体积90 L的玻璃箱体，每个箱体投放70 ind黑鲷，实验溶液总体积为40 L。将0#柴油和东海平湖原油水溶分母液和天然海水按比例混合，设置不同实验浓度梯度：0#柴油 (0.06 mg·L-1、0.03 mg·L-1、0.015 mg·L-1)东海平湖原油(0.12 mg·L-1、0.06 mg·L-1、0.03 mg·L-1)，经沙滤的天然海水作为对照组，每组设3个平行样。实验期间24 h连续充氧，水温为23.60～25.40 ℃。每天100%更换实验溶液一次，并及时清除排泄物以及活力不好的黑鲷个体。黑鲷饵料为配合饲料，每天 8∶00和18∶00分别投喂一次，投喂量为黑鲷体质量2%。胁迫实验进行15 d，15 d后将实验溶液全部换成清洁砂滤海水进行为期6 d的恢复实验。

1.2 血细胞样品制备

分别于实验第3天、7天、15天和21天各取3 ind黑鲷，采用断尾法取黑鲷外周血10 μL，迅速加入0.2 mL的磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 7.4)中制成血细胞悬液，置于4 ℃冰箱中保存3 d后检测。

1.3 彗星实验

胶板制备(烤胶法)[14]：在烧杯里配置100 mL 0.6%正常熔点琼脂糖，煮沸后，放入磨砂玻片并取出，室温凉干。37 ℃下，取75 μL低熔点胶与25 μL血淋巴混匀，用枪直接把凝胶吹到玻片上，4 ℃放置10 min。裂解：将玻片放入裂解液(2.5 mmol·L-1NaCl、100 mmol·L-1Na2EDTA、10 mmol·L-1Tris-base，pH=10)，用前加TritonX-100 和DMSO，4 ℃裂解2 h，取出玻片，用0.2 mol·L-1pH=7.4 的磷酸钠缓冲液漂洗。解旋：将玻片放入水平电泳槽中, 倒入新鲜的电泳缓冲液(0.3 mol·L-1NaOH、1 mmol·L-1Na2EDTA, pH>13)，4 ℃避光放置20 min 以解旋。电泳：调整电压为25 V，调整液面高度使电流达到300 mA，4 ℃避光电泳20 min。电泳结束，用磷酸钠缓冲液漂洗玻片。中和：用预冷的中和液(0.4 mmol·L-1Tris-base， pH 7.5)； 4℃漂洗3次，每次10 min。染色和观察：在胶板上滴加核酸染料gene finder，染色15 min 后，在Nikon80i 荧光显微镜200倍下，进行显微摄影，每组3个平行，每个平行组采集60 cell细胞进行拍照和数据分析[15]。

1.4 数据处理

先通过T检验方法进行组间差异比较，再采用SPSS 软件进行单因素方差分析(ANOVA)，同时采用LSD多重比较法检验各浓度组与对照组之间差异的显著性。用CASP 软件分析彗星图像，计算出彗尾长度、彗尾DNA相对含量(Tail DNA%)等参数，并以彗尾长度/核直径(TL/D)值衡量损伤程度作为DNA损伤指标，比值在0.3以下为轻微损伤或1级损伤，0.3～0.6之间为中级损伤或2级损伤，大于0.6为严重损伤或3级损伤[16]。

2 结果与分析

2.1 DNA损伤形态

图1为不同浓度0#柴油和东海平湖原油胁迫15 d后黑鲷血细胞的彗星图片。其中平湖原油低、中浓度组(0.03、0.06 mg·L-1)与对照组无显著差异，因此图中仅以高浓度组(0.12 mg·L-1)为例进行分析。由图1可见，对照组的血细胞核大小均一，呈现圆形的、边缘光滑、规则的荧光头部，无拖尾现象(图1-a)，这表明细胞未发生DNA断裂。其余浓度组则引起不同程度的核DNA 损伤，0.03 mg·L-1和0.06 mg·L-10#柴油胁迫下，黑鲷血细胞核有彗星状的尾从核中伸向阳极, 形成一个紧连荧光头部的尾部(图1-b和图1-c)，0.06 mg·L-1浓度组的彗尾更长；高浓度组的平湖原油(0.12 mg·L-1)染毒后，有一定数量的凋亡细胞出现，彗星头部小，尾巴大且呈偏圆状(图1-d)。

2.2 DNA损伤指标

不同浓度0#柴油和东海平湖原油染毒组对血细胞彗尾DNA相对含量的影响见表1。由表1可见，各浓度组血细胞彗尾DNA相对含量随着处理时间的延长持续上升。0#柴油中、高浓度组(0.03 mg·L-1、0.06 mg·L-1)在从第7天就对血细胞DNA造成显著损伤(P<0.05)，低浓度组(0.015 mg·L-1)对各个时间点血细胞DNA的损伤均不显著。东海平湖原油只有高浓度组(0.12 mg·L-1)第15天时对黑鲷血细胞DNA损伤效果显著(P<0.05)，其余试验组对血细胞DNA均未造成显著性损伤。恢复实验结束后，两种油的高浓度组彗尾DNA相对含量仍显著高于对照组水平(P<0.05)。

图1 0#柴油和东海平湖原油暴露后第15天对黑鲷血细胞DNA 损伤的彗星图像(200×)Fig.1 Comet assay images of DNA damage in hemolymph cell of Sparus microcephalus exposed to No.0 diesel oil and Pinghu crude oil on the 15th d

表1 0#柴油和东海平湖原油处理后的黑鲷血细胞彗尾DNA相对含量(%) (n=3)Tab.1 Percentage of damaged DNA with tail treated by No.0 diesel oil and Pinghu crude oil

注：*表示与对照组对比有显著差异(P<0.05)

Note:*means significant differences from the control at the same sampling time(P<0.05)

以彗尾DNA相对含量和两种石油烃污染物浓度作线性回归分析，得到表2所示的效应方程。由表2看出，黑鲷血细胞彗尾DNA相对含量与0#柴油和东海平湖原油存在一定的浓度-效应正相关关系，其相关系数均达到0.85以上。

表2 黑鲷血细胞彗尾DNA相对含量和0#柴油和东海平湖原油浓度效应方程Tab.2 Correlation coefficients between percentage of damaged DNA with tail and concentration of No.0 diesel oil and Pinghu crude oil

2.3 DNA损伤程度

表3为0#柴油和东海平湖原油处理后的黑鲷血细胞受损DNA的TL/D值。第7天时低、中浓度组0#柴油(0.015、0.03 mg·L-1)和东海平湖原油(0.03、0.06 mg·L-1)对黑鲷血细胞造成的DNA损伤程度以2级为主(<0.6)，高浓度组0#柴油(0.06 mg·L-1)和东海平湖原油(0.12 mg·L-1)以3级损伤为主(>0.6)，损伤率大于80%；第7天后各试验组DNA损伤程度继续上升，除低浓度组以外，其余试验组DNA损伤严重，损伤程度明显高于对照组(P<0.05)。第21天恢复实验以后，中、高浓度组TL/D值与对照组仍有显著差异(P<0.05) 。

3 讨论

DNA损伤是评价环境污染物遗传毒性的重要参数之一。MITCHELMORE等[17]认为污染物会影响DNA的转录过程从而引起DNA切口数量的减少，并引起DNA损伤。也有研究[18-21]指出，有机污染物进入生物体内后，在生物转化酶的作用下进行生物转化，亲脂性底物在细胞色素P450酶系代谢作用下转化为更具极性的中间代谢产物，这些中间代谢产物与DNA结合会造成DNA的损伤，该转化过程中往往伴随着活性自由基的大量产生，这些自由基若不能被生物体内的抗氧化防御系统及时清除，则会造成过量，从而对机体产生氧化胁迫，攻击核酸产生氧化损伤，使DNA双链、单链发生断裂或损伤，导致其缺失部分遗传信息，从而引发毒性效应。

表3 0#柴油和东海平湖原油处理后的黑鲷血细胞受损DNA的TL/D值Tab.3 TL/D value of damaged DNA treated by No.0 diesel oil and Pinghu crude oil

注：*表示为与对照组对比有显著差异(P<0.05)

Note:*means significant differences compared to the control at the same sampling time(P<0.05)

许多研究已表明，水生生物不同组织中DNA损伤效应随暴露浓度的增加和处理时间的延长，表现出一定的剂量-效应关系关系。例如王晓艳等[22]研究发现，低浓度(0.08 mg·L-1)石油烃在短时间内即可对扇贝血细胞DNA造成损伤， DNA损伤程度与石油烃浓度呈明显的剂量-效应关系，当石油烃浓度≥0.88 mg·L-1时，DNA严重损伤，恢复实验后DNA损伤程度也有不同程度的恢复，但整体较对照组显著。周海龙等[23]的研究也表明，多氯联苯、苯并[a]芘、滴滴涕等典型的持久性污染物对紫贻贝不同组织中DNA损伤作用均存在较为明显的剂量-效应关系。本研究结果也发现0#柴油和东海平湖原油对黑鲷血细胞的DNA损伤呈现剂量-效应关系。不同浓度的0#柴油和东海平湖原油处理下，黑鲷血细胞DNA受到了不同程度的链断裂和损伤，损伤效应表现为：随0#柴油和东海平湖原油浓度的增高，损伤的细胞数逐渐增多且损伤程度加重(图1)。由表1和表3可见，实验从第3天开始，0#柴油和东海平湖原油试验组就检测到DNA损伤，随着处理时间的延长，黑鲷血细胞彗尾DNA相对含量和TL/D值均呈上升趋势，DNA损伤级别也逐渐升高；第21天恢复实验以后，中、高浓度组与对照组仍有显著性差异(P<0.05)，低浓度组由于损伤较轻，在恢复实验期间机能逐步恢复，与对照组差异不显著。表2表明，黑鲷血细胞彗尾DNA相对含量与两种石油的浓度均呈现正相关。郁昂等[24]报道的0#柴油对僧帽牡蛎鳃和消化腺的DNA损伤效应也与本实验相一致。由此推断，鱼类DNA损伤可以作为石油污染评价的毒性效应指标之一。

本实验研究中， 0#柴油和东海平湖原油虽均能引起黑鲷血细胞DNA损伤，但相同浓度的0#柴油和东海平湖原油试验组比较而言，0#柴油试验组的黑鲷彗尾DNA相对含量(Tail DNA%)和TL/D值更高，DNA损伤更严重(表1和表3)，这表明0#柴油对黑鲷血细胞的遗传毒性更为显著，蒋玫等[25]研究了0#柴油和平湖原油胁迫对缢蛏的毒性效应，通过计算分析IBR数值也发现，0#柴油生物毒性大于平湖原油生物毒性。此外，国外学者的研究也表明原油毒性更小，TATEM 等[20]在不同油类对河口甲壳类动物的毒性研究中发现原油毒性比成品油毒性小，并指出石油产品的毒性与芳族烃含量密切相关，尤其是萘和相关烃类影响最大。RICE等[26-27]通过研究多种海洋生物对油类的敏感程度发现，无论是鱼类还是节肢动物、软体动物等，原油对大多数海洋生物的毒性效应都小于2#燃油；吴彰宽等[28]分析了不同油类对中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)受精卵、仔虾和幼虾三个发育时期的影响，结果表明轻柴油的毒性大于原油。已有研究[29]发现0#柴油中仅有20%～30%的组分是芳香烃，而平湖原油中芳香烃约占25%～35%，可能正是因为两者的芳香烃含量不同致使对黑鲷的毒性效应有所差异[30]，而其它组分的影响还有待进一步研究和验证。

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Effects of the No.0 diesel oil and Pinghu crude oil on the DNA damage of hemolymph cell inSparusmicrocephalus

DONG Ran1, 2, SHEN Xin-qiang1, JIANG Mei1, LI Lei1, YANG Jie-qing1, 2, XU Gao-pen1,2

(1.EastChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Shanghai200090,China; 2.CollegeofMarineSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Individuals ofSparusmicrocephaluswere exposed to various concentrations of water-soluble fraction of the diesel NO.0 (0.015 mg·L-1, 0.03 mg·L-1, 0.06mg·L-1) and the crude oil from Pinghu sea area (0.03 mg·L-1, 0.06 mg·L-1,0.12 mg·L-1) to evaluate the DNA damage made by the diesel NO.0 and the crude oil from Pinghu sea area on the marine fish. Hemolymph cells were collected fromSparusmicrocephalusunder different exposure time(3 d,7 d,15 d and 21 d)，and comet assay was used to detect the DNA damage of hemolymph cells. The results showed that there was dose-effect relationship between the DNA damage and the oil concentration. The DNA damage degree increased with increasing of the concentration of diesel NO.0 or crude oil from Pinghu sea area. Only in the 3rd day after exposed to the two oil pollutants, slight damage to hemolymph cells was detected, but mainly on the 1 level. However, with increasing of the oil concentration and prolonging of the stress time, the relative content of tail DNA and the ratio of tail length to nucleus diameter tended to increase, which indicated that DNA damage level was increasing gradually. When recovery period was over, tail DNA percentage (DNA%) andTL/Dof the diesel NO.0 exposure groups under the concentration of 0.03 mg·L-1and 0.06 mg·L-1were still significantly different from the control group (P<0.05) , so were those induced by the crude oil from Pinghu sea area exposure groups of 0.06 mg·L-1and 0.12 mg·L-1. Based on the DNA damage degrees made by different groups，it could be concluded that the toxic effects made by the diesel NO.0 was more serious than those made by the crude oil from Pinghu sea area. The comet assay is proven to be a useful tool to evaluate the genotoxicity of environmental contamination like oil, and the DNA damage of fish hemolymph cell could be a biomarker to monitor the marine oil pollution．

diesel NO.0; crude oil from Pinghu sea area;Sparusmicrocephalus; DNA damage; comet assay

1004-2490(2017)02-0173-08

2016-03-28

中国水产科学研究院基本科研业务费(2014A02XK01);农业部应对溢油关键技术专项(2012-2014);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2014T06)

董 冉(1990-)，女，硕士研究生，主要研究方向为水环境毒理学。E-mail: 197668825@qq.com

沈新强，研究员。E-mail:xinqiang_shen@hotmail.com

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