不同地理群体三疣梭子蟹mtDNA本底甲基化水平分析

闻奋亮，王银海，赵 莲，赖晓芳,2,3，阎斌伦,2,3，高 焕,2,3

(1．淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏省海洋生物技术重点实验室，连云港 222005；2. 江苏省海洋资源开发研究院，连云港 222001; 3. 江苏省农业种质资源保护与利用平台，南京 210014)

不同地理群体三疣梭子蟹mtDNA本底甲基化水平分析

闻奋亮1，王银海1，赵 莲1，赖晓芳1,2,3，阎斌伦1,2,3，高 焕1,2,3

(1．淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏省海洋生物技术重点实验室，连云港 222005；2. 江苏省海洋资源开发研究院，连云港 222001; 3. 江苏省农业种质资源保护与利用平台，南京 210014)

利用重亚硫酸盐测序法，对适于三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)线粒体基因组甲基化分析的BSP(Bisulfite sequencing PCR)引物进行了筛选，在设计的21对引物中，获得了12对BSP引物。利用这12对引物分析了三疣梭子蟹海州湾群体(江苏连云港)和莱州湾群体(山东东营)线粒体基因组本底甲基化水平，结果表明：海州湾群体不存在甲基化现象，莱州湾群体发现了2个个体在ND2基因(NADH脱氢酶亚基2)位点存在甲基化现象；在存在甲基化的个体中，甲基化类型主要为CHG和CHH类型，还有少量CpG类型。该研究结果说明，莱州湾群体和海州湾群体线粒体基因组本底水平上的甲基化特征存在一定差异，相关研究值得进一步深入探讨。

三疣梭子蟹; 线粒体基因组; 甲基化; 地理群体

表观遗传学阐释了内在遗传物质和环境互作的关系，因不断有新的发现被报道，因此一直是生命科学研究的热点之一[1]。表观遗传的主要机制包括DNA甲基化、核染色质修饰、基因组印记及非编码microRNA变化等[2]，其中DNA甲基化是从细菌到高等生物都普遍存在的表观修饰现象[3]。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下, 以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体, 将甲基转移到特定碱基上的过程[4]。DNA甲基化与基因表达密切相关，其通过与反式作用因子相互作用或通过改变染色质结构而影响表达, 在细胞分化、发育、X 染色体失活、基因组印记及肿瘤发生中都起着重要的作用[5]。

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是我国黄渤海沿海地区最重要的经济蟹类之一，关于其种质资源的研究一直受到广泛的关注[6-7]。按照地理分布情况，三疣梭子蟹通常被划分成不同的地理群体，如舟山群体、海州湾群体、莱州湾群体等[8]。有学者认为，莱州湾群体是一个比较特殊的群体，几乎是封闭在莱州湾内，与其它群体基因交流的机会很少，而舟山和海州湾自然群体间则存在着比较广泛的基因交流[9-10]。目前，这些不同地理群体遗传特征的研究方法主要是采用核基因组序列标记[11-12]、线粒体序列标记[13-14]等方法展开的，这些不同的技术方法多角度反映出三疣梭子蟹不同地理群体的遗传差异特征，但一直未见表观遗传学特征差异方面的文献报道。本文对莱州湾和海州湾两个地理群体线粒体基因组本底水平的甲基化情况进行了研究，以期为更好地了解三疣梭子蟹种质资源的状况提供帮助。

1 材料与方法

1.1 实验材料

三疣梭子蟹海州湾群体和莱州湾群体分别采自江苏连云港和山东东营近海自然海捕个体，均为成年个体，其中海州湾群体平均体质量为(260±14) g，莱州湾群体平均体质量为(185±11) g。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取

利用DNA提取试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取两个群体三疣梭子蟹的总基因组DNA(内含线粒体基因组DNA)，经琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA样本的完整性，并利用蛋白核酸定量仪(Nano drop 2000)对DNA质量进行检测。

1.2.2 mtDNA甲基化引物设计、筛选

根据三疣梭子蟹线粒体基因组全序列[15]，利用甲基化引物设计软件Methprimer(www.urogene.org/methprimer)寻找三疣梭子蟹mtDNA序列中富含CG的区域，并据此设计了21对甲基化BSP(Bisulfite sequencing PCR)引物(见表1)。

利用重亚硫酸测序法试剂盒(EpiMarkTM, New Englang Biolabs Inc.)对由6个海州湾个体组成的混合基因组DNA进行处理，并以处理后的基因组DNA为PCR模板进行BSP 引物的验证和筛选；PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证有无，对有扩增条带的片段进行胶回收，经过克隆和测序获得引物扩增序列，与三疣梭子蟹线粒体基因组原序列对比确认是否为线粒体基因组的扩增产物。

1.2.3 不同地理群体线粒体基因组的甲基化分析

利用Ezup柱式动物基因组抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取海州湾和莱州湾群体各20 ind个体的基因组DNA，利用重亚硫酸测序法试剂盒(EpiMarkTM, New Englang Biolabs Inc.)对这些个体DNA分别进行处理，以上述筛选出的BSP引物对处理后的基因组进行PCR扩增，扩增体系为25 μL(5 μL EpiMark Buffer，0.5 μL 10 mM dNTPs，10 μM 正反向引物各0.5 μL，DNA模板6 μL，EpiMark 热启动酶1U,其余为ddH2O)。采用Touch-down PCR程序进行扩增：95 ℃起始变性30 s，然后执行95 ℃变性15 s，55 ℃复性30 s，68 ℃延伸45 s的循环，其中退火温度每个循环降低0.5 ℃，进行14个循环后再以48 ℃固定退火温度进行20个循环，循环结束后以68 ℃延伸5min,4 ℃保存。PCR产物经克隆、测序，采用QUMA软件( http://quma.cdb.riken.jp)把测序序列与原线粒体基因组序列进行对比，以确认甲基化的有无及特征。

2 结果

2.1 甲基化引物筛选结果

对设计的每一个引物，根据其在三疣梭子蟹线粒体基因组中位置进行了命名编号。在设计的21对BSP引物中，共获得12对PCR产物清晰、可重复的引物对，具体见表1，经过克隆测序验证，这些引物的PCR扩增区均为三疣梭子蟹线粒体基因组序列。部分引物的筛选结果见图1，其中1、2、3、4、5、6和7分别为表1中编号为9～15号的引物。

图1 部分BSP引物筛选结果Fig.1 Screening results of partial BSP prime pairs by PCR amplification

2.2 不同地理群体mtDNA甲基化特征

分别利用上述12对BSP引物对海州湾和莱州湾群体进行了甲基化特征分析。在海州湾20 ind个体中，没有发现甲基化现象；而在莱州湾群体中发现2 ind个体存在甲基化现象，其位置都是第21号BSP引物对的扩增区，即线粒体基因组序列中的14902～15120 bp区间，为ND2(NADH脱氢酶亚基2)基因中的部分序列，具体见图2。图2中的A为mtDNA中14902～15120区间的原序列，B为测序获得的此区间发生甲基化后的序列；与B中的序列相比，A中利用方框标出了发生甲基化的位点(当两个甲基化位点连在一起时，则把前一个加粗显示)，而作为对照，未发生甲基化的胞嘧啶C(黄色标出)则在B中转化为了胸腺嘧啶T(下划线标注)。

从图2中也可以看出，三疣梭子蟹线粒体基因组中甲基化类型主要为CHG和CHH类型，还有少量CpG类型(CGG 和CGH)(H为A、C或T)。在三疣梭子蟹线粒体14902～15120区间，共发现25个甲基化位点，其中CHG和CHH类型共计22个，占88%；CpG类型(CGG 和CGH)3个，占12%。

表1 三疣梭子蟹线粒体基因组BSP引物Tab.1 BSP primer pairs for mtDNA in P.trituberculatus

续表1

图2 21#引物扩增区的甲基化模式(框中标出的C位点为发生甲基化的位点)Fig.2 Methylation pattern of the amplification zone of primers 21#

3 讨论

线粒体基因组DNA为闭合环状双链结构，由于其富含AT序列，因此缺少典型的CpG岛结构，这给线粒体基因组甲基化位点的寻找带来了困难。之前的研究曾经在脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)线粒体基因组中利用Methprimer软件通过覆盖全基因组的设计方法来考查整个线粒体基因组水平上的甲基化特征，设计了51对引物，但只有10对引物具有有效的扩增结果[16]。本研究利用Methprimer软件先对CG富含区(序列中CG含量超过30%)进行筛选，然后以这些CG富含区为中心设计了21对引物，其中12对引物具有有效的扩增结果，这说明该策略对于线粒体基因组DNA甲基化BSP引物的筛选效果较好，对于指导类似研究具有参考价值。

已有研究证实莱州湾群体和海州湾群体在线粒体基因组DNA序列上存在遗传多样性差异[7]，本研究发现在线粒体基因组甲基化本底水平上，海州湾群体和莱州湾群体也存在一定差异：莱州湾群体存在一些甲基化的个体，而海州湾群体则没有。当然，这是否是两个群体间特定差异特征还有待进一步验证。一方面，限于人力和物力条件(重亚硫酸盐测序法试剂盒价格高、需要克隆测序的数量也很大)，只分析了两个群体的各20 ind个体；另一方面已有的研究表明，多种环境因素和生理状况都会影响基因组或者线粒体基因组DNA水平上的甲基化状况，包括重金属[17]、饲料营养成分[18]、饥饿状态[16]等，因此取样背景的差异也可能造成结果的不同。

本研究结果表明,三疣梭子蟹线粒体基因组甲基化类型主要为CHG和CHH类型，还有少量CpG类型(CGG 和CGH)(H为A、C或T)，这与同属甲壳动物的脊尾白虾中发现的线粒体基因组甲基化特征略有不同，与哺乳动物相比更存在较大差异。在脊尾白虾中，是以CpG类型为主，而CHG和CHH类型较少[16]。在哺乳动物中，DNA甲基化类型主要是CpG，而植物中除了CpG甲基化外，还有CHG和CHH的甲基化[19]。由此也提出了一个新的值得深入研究和探讨的问题，即甲基化类型是否也揭示了生物的进化程度。

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Analysis of methylation profile level in the background for the blue swimming crabPortunustrituberculatusof different geographical populations

WEN Fen-liang1, WANG Yin-hai1, ZHAO Lian1, LAI Xiao-fang1,2,3, YAN Bin-lun1,2,3, GAO Huan1,2,3

(1.CollegeofMarineLifeandFisheries,JiangsuKeyLaboratoryofMarineBiotechnology,HuaihaiInstituteofTechnology,Lianyungang222005,China; 2.JiangsuProvinceMarineResourcesDevelopmentResearchInstitute,Lianyungang222001,China; 3.JiangsuProvincialPlatformforConservationandUtilizationofAgriculturalGermplasm,Nanjing210014,China)

For the high scientific and commercial value, the protection and utilization of germplasm resource of the blue swimming crab,Portunustrituberculatus, has attracted more and more attentions in past decades. The blue swimming crab is widely distributed in the coastal areas along the Bohai Sea, the Yellow Sea, the East China Sea and the South China Sea. Previous studies showed that the wild population located in Laizhou bay of Bohai Sea was different from the other populations, and only obseved in the Laizhou bay. The evidences supporting the conclusions above mainly came from the comparative analysis of nuclear DNA and mtDNA sequences among different populations. To obtain more evidences, the genetic differences between Laizhou bay population and other populations were compared at the level of epigenetics. Based on the Bisulphite Sequencing, the BSP (Bisulfite sequencing PCR) primer pairs of mtDNA were screened inP.trituberculatus. In the designed 21 primer pairs, twelve were useful for analyzing the methylation profiles of mtDNA. Then the methylation background levels of two geographical populations, Haizhou bay (Lianyungang of Jiangsu province) and Laizhou bay (Dongying of Shandong province) were clarified by the 12 primer pairs. The results showed that no methylation phenomenon was found in Haizhou bay population, while 2 individuals with methylation were found in the Laizhou bay population. The methylation sites were located in the gene of ND2. Excluding few CpG type, the main methylation types in the methylated individuals were CHG and CHH (H is A, C or T). The findings provide further evidences for proving that the Laizhou bay population is different from the Haizhou bay population.

P.trituberculatus; mtDNA; methylation; geographical populations

1004-2490(2017)02-0190-07

2016-06-15

江苏省水产养殖学品牌专业建设经费；2014年度江苏省大学生实践创新训练计划项目(5509013)；国家自然科学基金(31472282)；江苏省高校自然科学研究重大项目(13KJA240001)；“江苏省水产三新工程(D2014-17)；江苏省高校“青蓝工程”培养基金

闻奋亮(1993-)，男，2012级水产养殖学专业本科生,主要从事甲壳类遗传学研究。 E-mail:451460713@qq.com

高 焕，副教授。E-mail: huanmr@163.com

S 965.199

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