木薯主栽品种高效再生体系的建立与优化

韦祖生 杨秀娟 田益农

摘要[目的]通过研究建立木薯主栽品种的再生体系，获得更多的优质研究材料。 [方法]根据细胞全能性理论，以木薯幼叶、腋芽为材料，优化培养基组分，诱导木薯体细胞发生、分化，器官等发育，培养再生株系。[结果] 不同品种材料间的再生能力总体表现由大到小为：GR3、SC205、GR9891、GR911；腋芽诱导体细胞胚性愈伤组织的效果明显优于幼叶；IBA 诱导木薯体细胞胚发生效果优于6-BA，且二者间具有互作作用；IBA 与NAA 激素组合对诱导木薯不定芽生根效果优于单一使用效果。[结论] 建立了4个木薯主栽品种（SC205、GR891、GR911和GR3）高效的再生体系，为木薯种质保护、创新利用研究提供技术基础。

关键词木薯；幼叶；腋芽；体细胞胚；再生

中图分类号S533文献标识码A文章编号0517-6611（2017）35-0009-04

Abstract[Objective] The aim was to obtain more highquality research materials by constructed regeneration system of cassava cultivars. [Method] According to the cell totipotency， with young leaves and axillary buds as materials， we optimized the medium composition， induced the somatic embryogenesis and differentiation， as well as organ development， and cultivated regeneration lines. [Result] The regeneration abilities for four cultivars were in the order of GR3， SC205， GR9891， GR911；the axillary buds were better than young leaves to induce somatic embryonic callus；IBA had much better effect to induce the formation of cassava somatic embryo than 6BA， and they showed synergistic effect；The combination of IBA and NAA had better effect to induce the rooting of adventitious buds than using only one. [Conclusion] Efficient regeneration systems for four main cassava cultivars （SC205， GR891， GR911 and GR3） were established， which provided technical basis for protection and innovation of cassava germplasm.

Key wordsCassava；Young leaf；Axillary bud；Somatic embryo；Regeneration

木薯（Manihot esculenta crantz）原产于南美洲亚马逊流域，由于其淀粉产量高、用途广、种植生产管理条件要求不高等原因，是热带、亚热带地区重要的粮食和经济作物 [1-3]。随着中国工业的高速发展，每年都需进口大量木薯干片和淀粉[4]。因此，发展木薯优良品种培育和节约化栽培技术，可打破制约木薯产业发展的瓶颈。分子育种技术在提高木薯淀粉产量、改良淀粉品质、提高逆境抗性等方面具有比传统育种方式更大的优势。但要运用分子育种技术进行木薯遗传改良，先决条件是要建立起体细胞再生及遗传转化体系。已有相关报道建立了TMS60444脆性胚性愈傷、次生胚状体子叶、叶盘法以及次生胚状体等再生转化体系[5-7]，而针对种植生产主要品种的再生转化体系研究相对缺乏[8]。笔者选择了目前种植生产上应用广泛的4个栽培品种（SC205、GR891、GR911和GR3）为研究对象，通过外植体选择、培养基优化等建立起这4种主要栽培品种的再生体系，为建立木薯遗传转化（改良）体系提供技术基础。

1材料与方法

1.1材料

选用的4个主要栽培木薯品种为SC205、GR891、GR911和GR3，均由广西亚热带作物研究所提供。

参考Zhang 等[7]研究结果，改良了如下6种培养基：① M1（ MS+2 μmol/L CuSO4+ 2.0% 蔗糖+0.3% Gelrite，pH 6.0）；② M2（M1+12.0 mg/L 6-BA）；③ M3（M1+毒莠定，或2，4-D）；④ M4（M1+ 6-BA，或IBA，或6-BA+ IBA）；⑤ M5（M1+0.15 mg/L 6-BA）；⑥ M6（M1+ IBA，或NAA，或IBA+NAA）。

1.2方法

1.2.1制备无菌苗。

取木薯嫩枝，用酒精、升汞除菌后在M1培养基上继代培养，获得无菌苗，在M1培养基上继代、扩繁，备用。

1.2.2诱导外植体膨大。

从培养28 d的无菌苗上切取1.0～1.5 cm带腋芽的茎段或者不超过6.0 mm的幼叶，水平放置在M2培养基上，30个外植体/皿，10皿/品种，26.0 ℃，16.0 h（800～1 000 Lx）光照，膨大培养3～7 d，观察并记录。

1.2.3诱导胚性愈伤组织的发生、分化。

选用2，4-D及毒莠定为诱导激素，2，4-D及毒莠定均设置6.0、12.0、14.0及18.0 mg/L共4个浓度梯度，分别添加在M1培养基上，获得诱导培养基M3。挑取膨大腋芽（约1.0 mm）或者从茎尖1.0～2.0 mm幼叶转移到M3，30个/皿，5皿/处理；26.0 ℃暗培养。每2 d在体视显微镜下观察胚性愈伤的发生情况，第4天开始统计初生胚的数量，计算出胚率。当球型或鱼雷型胚出现时，立即转移、继代到新鲜M3培养基上培养。

1.2.4诱导体细胞胚的分化、成熟。

将初生胚状体分离、转移到M4培养基上继代培养，诱导次生胚状体分化、增殖，每14 d继代1次，建立循环培养，观察并统计增殖速率。

将4～5个体细胞胚组成愈伤簇放置于M5培养基，26.0 ℃光照培养（800～1 000 Lx）16.0 h，每4 d观察1次，直至子叶明显膨大、变绿，于第8天统计成熟度。取12、16 d的成熟胚，转移到M6培养基上诱导萌发、生根，第25、30天后统计生根苗数。

1.2.5子叶诱导次生体细胞胚胎、芽器官发生以及子叶成熟与萌发。

取12 、16 d的成熟子叶切片（约0.25 cm2），置于M3培养基上，30个/皿，5皿/品种，26.0 ℃暗培养，每3 d观察次生胚状体的发生情况，15 d后统计出胚率。

将成熟子叶切片（约0.25 cm2），置于M6培养基上，30个/皿，5皿/品种，26.0 ℃暗培养，每3 d在体视显微镜下观察次生胚状体的发生情况。21 d后统计不定芽诱导情况。

将芽原基及再生不定芽发育成熟材料转移至M6培养基，26.0 ℃光照培养（800～1 000 Lx）16.0 h，每4 d观察1次，直至长成幼苗，第12、16天统计生根苗数。

1.2.6不定芽生根与移栽。

将离体再生株系转移到M1培养基上，光照培养。21 d后，将生根良好、健壮材料进行开瓶、炼苗后取出，用清水洗净附着在根系上的培养基，尽量避免不定根的断裂，然后移栽到培养基质营养杯中；放置于温室中培养、观察，并注意定时通风换气、保温、保湿；21 d后，再生株系可进行大棚移栽。

1.3数据处理与分析

采用Excel和 SAS 9.0软件进行数据处理和分析[12]。

2结果与分析

2.12，4-D及毒莠定对4个木薯品种幼叶诱导胚性愈伤的影响

由表1可知，2，4-D和毒莠定对4个木薯品种的幼叶诱导胚性愈伤均有积极效应。在相同的诱导条件下，GR3的幼叶诱导胚性愈伤数量极显著多于SC205、GR891和GR911，而其他3个品种间的差异性不显著，胚性愈伤诱导力从大到小依次为GR3、SC205、GR891、GR911；相同木薯品种在不同激素水平诱导条件下，2，4-D浓度为12.0和14.0 mg/L时，幼叶诱导胚性愈伤数量多于6.0和18.0 mg/L，呈显著性差异；毒莠定浓度为12.0和14.0 mg/L时，幼叶诱导胚性愈伤数量大于6.0和18.0 mg/L，呈显著性差异。除GR911在2，4-D为14.0 mg/L时诱导效果好于12.0 mg/L外，其余3个品种均在2，4-D为12.0 mg/L时诱导效果最好。4个木薯品种的毒莠定为12.0 mg/L时，诱导效果最好。综合2种生长调节剂不同浓度的结果可知，木薯品种间基因型对诱导胚性愈伤能力具有差异性。

2.22，4-D及毒莠定对4个木薯品种腋芽诱导胚性愈伤的影响

由表2可知，2，4-D和毒莠定对4种木薯栽培品种的腋芽均可诱导胚性愈伤。不同木薯品种在相同的诱导条件下，GR3的腋芽诱导胚性愈伤数量显著多于SC205、GR891和GR911，其他3个品种间的差异性不显著，胚性愈伤诱导力从大到小依次为GR3、SC205、GR891、GR911；在不同激素水平诱导条件下，2，4-D浓度为12.0和14.0 mg/L时腋芽诱导胚性愈伤数量多于6.0和18.0 mg/L，差异性显著；相同木薯品种在不同激素水平诱导条件下，2，4-D浓度为12.0和14.0 mg/L时腋芽诱导胚性愈伤数量分别高于6.0和18.0 mg/L，差异性显著。2，4-D和毒莠定在12.0和14.0 mg/L时对4个品种的诱导效果均明显好于6.0和18.0 mg/L，4个品种均在毒莠定、2，4-D为12.0 mg/L时，诱导效果最好。2种生长调节剂不同浓度的试验结果显示，木薯品种间诱导胚性愈伤能力有较大差异，可以分为2组：GR3和SC205；GR891和GR911。前一组的诱导效果要明显好于后一组。

2.3不同植物生长调节剂组合对4种木薯品种胚性愈伤分化的影响

由表3可知，同一木薯品种在不同激素组合的诱导条件下，IBA+6-BA诱导胚性愈伤分化数量显著多于IBA、6-BA；其中IBA、6-BA间的差异不显著，诱导优越性排序从大到小依次为IBA+6-BA、IBA、6-BA；IBA浓度为1.5和2.0 mg/L時，诱导胚性愈伤分化数量显著多于1.0 mg/L；6-BA浓度为0.8 mg/L时，诱导胚性愈伤分化数量显著多于0.4和1.2 mg/L；IBA+6-BA浓度为（1.5+08） mg/L时，诱导胚性愈伤分化数量显著多于（1.5+0.4） mg/L和（1.0+0.4）mg/L。

IBA和6-BA单一均能诱导木薯的胚性愈伤发生不同程度的分化，而二者混合使用诱导时效果明显提高，说明2种激素间具有一定程度的协同作用。IBA 1.5 mg/L+6-BA 0.8 mg/L的组合对木薯胚性愈伤的诱导分化效果最好。从品种间响应来看，GR3（73.2%）略优于SC205（70.4%），但均明显优于GR911（60.2%），GR891（50.8%）最差，说明不同品种间呈显著性差异。

2.4不同植物生长调节剂组合对4个木薯品种不定芽诱导生根的影响

由表4可知，同一木薯品种在不同激素的诱导条件下，1/2IBA+1/2NAA处理不定芽诱导生根均优于IBA和NAA，呈显著性差异，而其IBA和NAA间的差异性不显著，诱导能力从大到小依次为1/2IBA+1/2NAA、IBA、NAA；IBA浓度为1.00和1.50 mg/L时，诱导不定芽和生根均优于1.00 mg/L，呈显著性差异；NAA浓度为1.00和1.50 mg/L时，诱导不定芽、生根均优于1.00 mg/L，呈显著性差异；当1/2IBA+1/2NAA mg/L浓度为（0.50+0.50） mg/L和（0.75+0.75） mg/L时诱导不定芽、生根均优于（0.25+0.25） mg/L，呈显著性差异。

IBA和NAA均能诱导木薯再生组织不定芽生根，而二者的混合使用效果明显优于单一使用效果，说明2种激素之间具有一定程度的协同作用。除GR891在IBA 1.5 mg/L时达到最大生根率14.1%，其余3个品种均在IBA 1.00 mg/L达到最大生根率；4个品种均在NAA 1.00 mg/L 时达最大生根率；除GR911在IBA 0.75 mg/L +NAA 0.75 mg/L达到最大生根率18.5%外，其余3个品种均在IBA 0.50 mg/L +NAA 0.50 mg/L达最大生根率；不同木薯品种分析显示，GR3与SC205最好，其次是GR891，而GR911最差。

2.5木薯主栽品种腋芽、幼叶高效再生体系的建立与优化

从图1可以看出，木薯主栽品种均可以腋芽（A）、幼叶（B）为外植体，诱导获得胚性愈伤（C），通过胚性愈伤的成熟（D）、分化（E），获得体细胞胚（F），体细胞胚进一步成熟，获得带子叶的体细胞胚（G），或者诱导体细胞胚分化获得不定芽（H），将不定芽剪下诱导生根（I），炼苗后移入大棚栽培。

3讨论

相关研究结果[5-7]显示，以4个木薯主栽品种SC205、GR3、GR891和GR911的腋芽、幼叶为外植体，通过诱导、培养激素水平的优化，建立了体细胞胚再生株系途径。同一种植物的不同品种间由于基因型的差异，其再生能力也具有较大的差异；木薯再生及遗传转化体系已在少数几个模式材料获得了成功，但由于基因型的差异，很难直接运用到栽培品种中[8-11]。目前，我国主要栽培的木薯品种再生及遗传转化体系尚未有效建立，这成为采用植物分子育种技术对其进行改良的瓶颈。

4结论

研究发现，4个栽培品种间的再生能力有较大差异，从大到小依次为GR3、SC205、GR9891、GR911。笔者等通过培养基植物生长调节剂优化，建立了4个木薯主要栽培品种的体细胞胚的再生体系，为建立农杆菌介导的遗传转化体系改良木薯栽培品种打下了良好基础，在生产实践中具有重要意义。

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