软枣猕猴桃原生质体酶解液配方筛选

付鹏跃 刘德江 申健 吕明医 梁雪莹 董实伟 程海涛

摘要[目的]筛选软枣猕猴桃原生质体最佳酶解液配方。[方法]以4种配方酶解液在相同条件下处理等量软枣猕猴桃叶片，比较最后收集的纯化原生质体量，筛选最佳酶解液配方。[结果]配方Ⅲ（1.0%纤维素酶、0.5%离析酶、0.3%果胶酶）和Ⅳ（1.0%纤维素酶、05%果胶酶）处理酶解效果要明显优于配方 Ⅰ（2.0%纤维素酶、05%离析酶）、Ⅱ（2.0%纤维素酶、0.3%果胶酶）。[结论]配方Ⅲ（1.0%纤维素酶、05%离析酶、0.3%果胶酶）为软枣猕猴桃原生质体最佳酶解液配方。

关键词软枣猕猴桃；原生质体；酶解；配方筛选

中图分类号S603.6文献标识码A文章编号0517-6611（2017）05-0133-02

Screening of Enzymatic Hydrolysate Formula of Actinidia arguta Protoplast

FU Pengyue，LIU Dejiang，SHEN Jian，CHENG Haitao* et al

（College of Life Sciences， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract[Objective]To screen the best enzymatic hydrolysate formula of Actinidia arguta protoplast. [Method]The leaves of A. arguta were treated with four enzymatic hydrolysate formula under the same conditions. The purified protoplast was collected and compared to screen the optimal enzymatic hydrolysate formula. [Result] The amount of protoplast collected by the solution of formula Ⅲ （1.0% cellulase， 0.5% segregation enzyme and 0.3% pectinase） and formula Ⅳ（1.0% cellulase，0.5% pectinase）were significantly higher than the solution of formulaⅠ（2.0% cellulase， 05% segregation enzyme） and formula Ⅱ（2.0% cellulase， 0.3% pectinase）.[Conclusion]Formula Ⅲ（1.0% cellulase， 0.5% segregation enzyme and 0.3% pectinase） is the best enzymatic hydrolysate formula for A. arguta protoplast.

Key wordsActinidia arguta；Protoplast；Enzymatic hydrolysis；Formula screening

基金項目黑龙江省大学生创新项目（201610222104）。

作者简介付鹏跃（1993—），男，黑龙江肇源人，本科生，专业：生物科学。*通讯作者，副教授，硕士，从事植物资源学与生态学研究。

收稿日期2016-12-28

软枣猕猴桃（Actinidia arguta）属猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）多年生落叶木质藤本植物，俗名软枣子、猕猴梨、藤瓜，是猕猴桃属中在我国分布较为广泛的野生果树之一[1]，其主要分布在我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西、山东、河南、安徽、浙江、云南等省（区）以及朝鲜、日本等国家，多生长在山坡灌木林中、沟边、山顶杂木林中、山坡杂木林中。

我国对猕猴桃野生资源开展系统驯化和栽培有近50年的历史[2]。从20世纪60年代初开始进行软枣猕猴桃的选育，已选育出一批性状优良的品种，如中国农业科学院特产研究所选育的品种‘魁绿和‘丰绿，中国农业科学院郑州果树研究所选育的全红型品种‘天源红，四川省自然资源科学研究院选育的‘宝贝星等[3-7]。相较于美味猕猴桃和中华猕猴桃品种，软枣猕猴桃品种较少，无法满足产业对品种多样化的需求。加强软枣猕猴桃新品种的研究，选育优良品种，对促进我国软枣猕猴桃产业发展具有重要意义[8]。

原生质体（Protoplast）指通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分细胞物质[9]。目前原生质体培养已经在中华猕猴桃、美味猕猴桃以及毛花猕猴桃3个种中获得成功，但对软枣猕猴桃原生质体培养的研究少见报道[10]。该研究以4种配方的酶解液处理软枣猕猴桃叶片，进行原生质体的酶解，旨在筛选出效果最为理想的酶解液配方。

1材料与方法

1.1材料

材料为软枣猕猴桃瓶装无菌苗叶片。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器。

JD500-3A分析天平（上海力衡仪器仪表有限公司）；笔式pH计（杭州盈傲仪器有限公司）；TD4台式低速离心机（上海本昂科学仪器有限公司）。

1.2.2试剂。

纤维素酶（Cellulase Onozuke R-10，北京明阳科华生物科技有限公司）；离析酶（Macerozyme R-10，上海伟进生物科技有限公司）；果胶酶（Pectolyas Y-23，常州市海拓实验仪器有限公司）；甘露醇。

1.3方法

1.3.1CPW培养基配制。

按照文献[11]方法配制CPW培养基，具体配方如下：30 mg/L KH2PO4、100 mg/L KNO3、1 320 mg/L CaCl2·2H2O、250 mg/L MgSO4·7H2O。配制50 mL CPW培养基，调节pH为5.6～5.8，高温灭菌后放入冰箱中保存待用。

1.3.2酶解液的制备。

试验共设4种酶解液配方，具体配方见表1。取4个10 mL烧杯，在每个烧杯中倒入6 mL CPW培养基，再放入0.728 6 g甘露醇作为渗透压稳定剂，调节pH至5.6，按照各组比例将纤维素酶、离析酶、果胶酶分别放入烧杯中，用CPW培养基定容到10 mL后充分摇匀，分装到4个锥形瓶中进行标记。此次试验叶片与酶解液质量比为1〖DK〗∶20。

1.3.3酶解试验。

配制完酶解液后用分析天平称量4份05 g叶片，将叶片剪碎到0.25 cm2左右，分别放入各组酶解液中充分摇匀，使每个碎片都浸没在酶解液中。将锥形瓶放入低速摇床中进行黑暗处理，25 ℃，4～8 h。分别于1、4、8 h观察记录叶片样品外观与酶解液的变化情况。

1.3.4原生质体收集与称重。

将锥形瓶中的叶片通过300目钢筛进行过滤，收集到的滤液分装入10 mL离心管中离心（300～500 r/min）5 min。离心后弃上清液，加入6 mL CPW培养基，再次离心（300～500 r/min）5 min。弃上清液后，将经过离心纯化的各组原生质体称重。

2结果与分析

2.1酶解1 h后观察结果

由表2可知，处理1 h后，与配方 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ酶解情况相比，配方Ⅳ无明显变化，配方Ⅲ与Ⅳ中可以清楚看到已经有部分叶片酶解出现了原生质体。配方 Ⅰ、Ⅱ 中的叶片无明显改变，配方Ⅲ与Ⅳ中叶片已经有质壁分离的趋势，叶片颜色开始变浅（图1）。

锥形瓶中叶片颜色变浅，叶片变软，叶片边缘出现毛边，酶解液较为清澈。配方Ⅲ与Ⅳ锥形瓶中叶片颜色变浅，叶片变软，顶部有透明白膜，叶片有分离的趋势，酶解液较为浑浊（表2）。

2.3酶解8 h后观察结果

处理8 h后4种酶解液中叶片酶解情况见图2。经观察发现，配方 Ⅰ、Ⅱ 锥形瓶中叶片仍比较完整，具备一定形状，叶片顶部出现白膜，轻轻晃动白膜仍未脱离，叶片边缘有比较明显的毛边，酶解液比较浑浊，总体上来说酶解效果不理想（表2）。配方Ⅲ锥形瓶中叶片已无固定形状，酶解液变为深绿色，肉眼可见大量绿色沉淀。配方Ⅳ锥形瓶中叶片也已经为游离态，但仍可见叶片碎片。

3结论

猕猴桃果富含丰富的VC、矿物质和花青苷等营养物质[12]，其主要营养成分位居水果的前列，且综合经济效益通常比一般水果高出3倍以上[13]。由于猕猴桃是新兴果树，对其遗传育种的研究时间不长，对软枣猕猴桃的研究更是有限，对原生质体分离工艺的筛选是对其进一步研究的基础。该试验以4种不同的酶解液配方筛选分离原生质体，试验结果表明，配方Ⅲ（1.0%纤维素酶、0.5%离析酶、0.3%果胶酶）和Ⅳ（1.0%纤维素酶、0.5%果胶酶）酶解效果要明显优于配方 Ⅰ （2.0%纤维素酶、0.5%离析酶）、Ⅱ （2.0%纤维素酶、0.3%果胶酶），但配方Ⅳ破碎较多。在供试酶解液中配方Ⅲ原生质体产量最多，破碎最少，所以配方Ⅲ应为软枣猕猴桃原生质体最佳酶解液配方。

参考文献

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