缺血预处理与维生素C对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响

殷涛

【摘要】 目的 探讨缺血预处理（IP）与维生素C（Vit C）对大鼠肝缺血再灌注损伤的影响。方法 选择80只健康雄性SD大鼠， 参照盲选法分成假手术组（S组）、行缺血再灌注组（IR组）、行缺血预处理组（IP组）、实施维生素C治疗组（Vit C组）， 各20只。制作70%肝缺血再灌注模型， 测谷丙转氨酶（ALT）及天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）含量；观察大鼠肝脏组织结构变化；检测肝细胞凋亡指数（AI）。结果 IR组、Vit C组于各个灌注时间点血清中ALT、AST含量均明显高于S组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。在电子高倍显微镜下， 可发现S组细胞中线粒体按照一定规律进行排列， 可极为清楚的看见细胞核的双重核膜结构， 且内质网未表现出异常扩张， 以较为规则的方式进行排布， 在嵴部未发现明显肿胀。结论 IP及Vit C对肝脏缺血再灌注损伤有显著的保护作用， 相比之下Vit C效果更好。

【关键词】 再灌注损伤；缺血预处理；维生素C；大鼠

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.31.126

肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）多出现在肝脏移植手术、常规肝脏手术以及其他创伤性较大手术而引发的缺血性休克， 同时因该症状的影响， 多数行肝脏类手术患者， 术后肝脏功能均会受到不停程度损伤， 严重时出现肝功能衰竭[1， 2]。本院主要针对维生素C的抗氧化作用对HIRI保护作用的实际效果进行探索， 望能为临床对于HIRI的治疗与预防控制方案的完善发挥作用。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 选择健康雄性SD大鼠80只， 由赤峰学院实验动物中心提供， 所有大鼠的喂养方式均相同， 体重200～250 g， 平均体重（231.12±10.38）g。实验中所用维生素C主要由陕西立众制药有限公司生产（国药准字H20046703）。脂质氧化（MDA）检测试剂盒、生化试剂SOD均来自南京生物工程研究院， 细胞凋亡试剂盒（POD）则主要从罗氏公司购置。本次研究中所有试剂均符合卫计委检测标准。依照盲选法， 随机分成S组、IP组、Vit C组、IR组， 各20只， 每组在1、3、6、12 h时间段同时进行再灌注。

1. 2 方法 运用Pringles法实施肝脏缺血再灌注模型的建立， 对大鼠腹腔注射麻醉剂实施麻醉， 依照惯用方式对皮肤进行消毒处理， 于大鼠剑突下方1 cm左右切开， 将肝脏进行游离， 同时将肝动、静脉加以分离。随即使用无创血管夹将主要供血动脉夹住30 min左右， 使得肝脏内无血液供应。然后采用再灌注的方式恢复肝脏内血流。假手术组（即S组）单进行麻醉连同肝脏血管分离操作， 不进行血管夹住。行维生素C治疗组（Vit C组）， 在使用血管夹夹住血管前5 min左右， 从大鼠尾部注射6 ml/kg维生素C。行缺血预处理组（IP组）则需要将肝脏左右动脉以及门静脉和胆总管同时夹住保持肝脏缺血约5 min， 之后保持血管畅通， 放血流大约5 min， 按照此种操作方式共同进行3次， 后续操作与Vit C组基本相同。行缺血再灌注组（IR组）则在夹住血管前5 min后， 于背部注射生理盐水6 ml/kg， 其他操作方式与Vit C组处理相同[3]。

1. 3 观察指标 取各组处理后大鼠使用全自动生化分析仪对血清中ALT、AST含量进行检测。在电镜协助下， 将使用戊二醛固定的肝脏细胞组织取出， 随即进行脱水、浸透、包埋等处理， 然后进行观察。针对原位细胞凋亡情况， 则主要使用TUNEL法加以检测， 在电子显微镜下， 若细胞核中部分部位表现为紫黑色， 則为阳性细胞， 观察组需在200倍视野下依照随机原则， 选取5块区域进行观察。AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2 检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 肝脏生化酶学的检测情况 Vit C组1、3、6、12 h的ALT、AST分别为（287.14±1.45）、（315.54±1.64）、（315.47± 1.64）、（308.15±1.68）IU/L和（624.25±1.67）、（674.15±1.71）、（684.25±1.67）、（698.15±1.26）IU/L， IR组分别为（675.14± 1.44）、（824.11±1.67）、（814.34±1.64）、（810.57±1.57）IU/L和

（958.54±1.34）、（962.14±1.24）、（976.28±1.24）、（1011.47±

1.57）IU/L， S组分别为（79.54±1.94）、（82.74±1.25）、（86.45± 1.64）、（79.55±1.29）IU/L和（241.64±1.64）、（243.25±1.26）、（286.18±1.57）、（284.15±1.24）IU/L， IR组、Vit C组各灌注时间点血清中ALT、AST含量均明显高于S组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。

2. 2 电镜观察肝细胞超微结构变化 在电子高倍显微镜下， 可发现S组细胞中线粒体按照一定规律进行排列， 可极为清楚的看见细胞核的双重核膜结构， 且内质网未表现出异常扩张， 以较为规则的方式进行排布， 在嵴部未发现明显肿胀。IR组细胞核膜基本消失， 无法对内质网的扩张情况进行清楚观察， 且线粒体表现为严重肿胀扩张， 可发现部分空泡存在明显变性。

2. 3 肝细胞凋亡情况 S组在各个时间点进行灌注时， 仅少数细胞出现凋亡， 但其他三组灌注时， 细胞凋亡数量明显高于S组（P<0.05）。同时各组AI伴随灌注时间的增加， 其含量也呈现上升的趋势。

3 讨论

HIRI的发生机制十分复杂， 结合临床有关研究可发现， 细胞凋亡也可归属到肝脏缺血且在灌注期间出现细胞死亡的范围内。在本次研究中， 大鼠肝表现为ALT明显升高， 同时肝细胞内的超微结构也都有明显损伤。

多细胞生物体多采用细胞凋亡的方式来维持自身组织以及细胞之间增殖与死亡的相互平衡， 因此细胞凋亡为自身基因掌控的自主细胞死亡。近几年， 有关学者研究发现， 体内氧自由基含量超过正常水平时， 将增加细胞凋亡。在本次研究中IR组、IP组、Vit C 组， 细胞凋亡数明显较S组高， 差异具有统计学意义（P<0.05）， 同时各组AI伴随灌注时间的增加， 其含量也呈现上升的趋势。

维生素C是细胞外液中最有效的水溶性抗氧化剂， 在人体内可起到降低脂质过氧化反应强度的作用。本次实验发现， 使用维生素C可有效抑制缺血在灌注过程中氧自由基的产生， 将对肝脏组织的损伤降至最小， 其总体效果优于行缺血预处理。

参考文献

[1] 王安生， 刘学刚， 王康武， 等. bFGF、MMP-2在肺血减少型先天性心脏病幼猪动物模型远端肺血管发育中的作用. 中华解剖与临床杂志， 2011， 16（5）：404-408.

[2] 周克斌， 赵留存， 杨勇， 等. 放疗对前尿道狭窄模型兔iNOs和MMP-2的影响. 现代泌尿外科杂志， 2012， 17（1）：32-35.

[3] 徐振宇， 高建平， 孙颖浩， 等. 非甾体类抗炎药对前列腺癌动物模型中RECK基因表达的调控. 江苏医药， 2010， 36（22）：2666-2668.

[收稿日期：2016-10-25]