基于“有故无殒”思想的雷公藤对肾小管S1和S2段保护与损伤的“双向作用”

2017-05-27张琴李健和

中国医药导报 2016年36期

张琴　李健和

[摘要] 目的基于“有故無殒”思想，研究不同剂量的雷公藤对肾小管S1段和S2段损伤急性肾衰模型大鼠肾毒性的差异。方法将雄性SD大鼠48只，按体重大小编号，按随机数字表法将其分为6组，每组8只，分别为空白组（N组）、模型组（M组）、模型组+1倍剂量雷公藤提取物（TWHF）组（MD1组）、模型组+2倍剂量TWHF组（MD2组）、模型组+4倍剂量TWHF组（MD3组）、模型组+8倍剂量TWHF组（MD4组）。采用氯化镉造模，4个TWHF剂量组按照3.13、6.25、13.5、27.0 g生药/kg给药。观察TWHF对肾小管S1段和S2段损伤大鼠的一般生长状态、肾脏脏器指数、血清生化指标（BUN、CREA、K+、Na+、Ca2+、Cl-）、肾脏组织病理改变的影响。结果与N组比较，M组体重下降，尿量减少，肾脏脏器指数升高，BUN、CREA、K+浓度显著增高，Na+、Ca2+浓度明显降低，肾脏病理可见肾小管损伤。与M组比较，MD1、MD2组体重早期稍增长，尿量无明显改变，肾脏脏器指数有所下降，MD1组BUN降低，CREA、K+浓度明显降低；MD2组BUN、K+浓度无明显改变，CREA水平显著降低，Ca2+浓度显著升高，MD1、MD2组肾脏病理损伤有所减轻。与M组比较，MD3、MD4组体重下降更为明显，每组各出现1例小鼠死亡，尿量明显减少，肾脏脏器指数进一步增高，BUN、CREA、K+、Ca2+进一步增高，Na+浓度明显降低，肾脏病理损伤进一步加重。结论低剂量TWHF在模型大鼠上表现出改善BUN、CREA、血清高K+和低Na+水平的保护作用，肾脏病理改变减轻，但高剂量时反而加重M组大鼠肾损伤。这证实了“有故无殒”的思想，因而临床用药时，需要把握不同病理状态的雷公藤的量-毒效差异。

[关键词] 雷公藤；肾脏保护；肾脏毒性；毒性差异

[中图分类号] R961 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0053-05

[Abstract] Objective Based on the "symptom-based prescription theory"， to study the differences in the renal toxicity of Tripterygium wilfordii Hook.f. on normal and acute renal failure model rats with tubular S1 and S2 damaged. Methods 48 male SD rats were randomly divided into 6 groups， which were normal group （N group）， model group （M group）， model +1 times dose TWHF group （MD1 group）， model +2 times dose TWHF group （MD2 group）， model +4 times dose TWHF group （MD3 group）， model +8 times dose TWHF group （MD4 group） respectively. The models were made by cadmium chloride， 4 TWHF dose groups were administered in 3.13， 6.25， 13.5， 27.0 g crude drug/kg. The general growth status， organ/bady coefficients， serum biochemical indexes and renal pathological changes were used to investigate the influence of the TWHF on physiological and pathological state. Results Compared with the N group， body weight of the rats and urine volume decreased， kidney organ index increased， BUN， CREA， K+ concentrations were increased significantly， Na+， Ca2+ concentrations were decreased significantly， pathological examination revealed renal tubular injury in M group. Compared with M group， body weight of the rats slightly increased at the early stage， urine volume did not change significantly， kidney index decreased in MD1 and MD2 groups. BUN was decreased， CREA and K+ were decreased significantly in MD1 group； BUN and K+ were no significant change，CREA was significantly decreased， Ca2+ concentration was significantly increased in MD2 group， the damage of kidney pathology had been improved in MD1 and MD2 groups. Compared with M group， body weight of the rats decreased significantly in MD3 and MD4 groups， 1 rat death in each group， urine volume was decreased significantly， kidney index was increased significantly， BUN， CREA， K+ and Ca2+ were increased further， Na+ concentration was decreased significantly， the renal pathological damage was aggravated. Conclusion Low-doses TWHF plays a protective role by improved BUN， CREA， serum high K+ ， low Na+ levels and the pathological change of kidney in the model rats. However， high-dose TWHF aggravated renal injury of the rats. This phenomenon has proved "symptom-based prescription theory". Therefore， it is necessary to grasp the different pathological state of the made the symptom-based prescription.

[Key words] Tripterygium wilfordii Hook.f.； Renal protection； Renal toxicity； Differences in toxicity

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）是卫矛科雷公藤属雷公藤的干燥根及根茎，又名黄藤木、断肠草、红药等，有大毒。雷公为神话中司雷之神，本品藉以为名，以喻其暴烈之性，《本草纲目拾遗》中记载“出江西者力大，土人采之毒鱼，凡蚌螺之类亦死，其性暴烈”[1]，归属于祛风湿药，具有免疫抑制、抗炎、抗菌、止痛、抗肿瘤等作用，尤其是对免疫性疾病有较好的疗效，临床常用于各种原发性和继发性肾炎，包括慢性肾小球肾炎、肾病综合征、过敏性紫癜肾炎、狼疮性肾炎等疾病的治疗，疗效显著[1-3]。但雷公藤的毒副作用较为严重，临床应用时不良反应时有发生，主要表现在消化、生殖、肝肾、血液等系统[4]。迄今报道的雷公藤的物质成分100余种[5]，包括生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类等，其中主要活性成分为生物碱类和二萜类，同时也是主要的两类毒性成分[6-7]。生物碱类包括雷公藤碱、雷公藤次碱、雷公藤宁碱等，可损害肝脏，并可破坏红细胞，引起进行性贫血，甚至诱发肾小管缺氧性损害和导致严重营养不良性改变。二萜类属松香烷型，具有α，β-不饱和内酯结构，包括雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤内酯三醇等。其主要损伤心、肝、胃肠道及骨髓。

雷公藤可用于多种肾脏疾病的治疗。雷公藤在治疗弥漫增生性肾病、系膜及内皮性肾病等方面均可能有效，在治疗紫癜性肾炎引起的血尿方面效果更为明显[8]。但雷公藤在治疗的同时，也可能对肾脏产生毒副作用。有研究表明，较高剂量或长期服用雷公藤中毒的患者中有1/3左右可出现肾脏损害，严重者可发生急性肾衰。雷公藤肾损害的病理改变为肾小管上皮细胞变性、坏死，发展至后期可累及肾小球[9]。雷公藤肾脏损害的部位主要在肾小管，因而对已有肾小管损伤的小鼠应用雷公藤，可能会更好地观察到雷公藤对于肾损伤的治疗效果，并可进一步放大其肾脏毒性，出现更加典型的表现。本研究观察正常小鼠和S1、S2段肾小管损伤小鼠应用雷公藤后的肾功能、肾脏形态、肾脏病理、电解质等，以评价雷公藤在不同剂量下分别表现出的肾脏保护作用及肾脏毒性作用，为科学评价雷公藤对肾脏的量-效/毒关系和指导临床合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

動物：雄性SD大鼠48只，SPF级，6～8周龄，体重（180±30）g，购于长沙市天勤生物技术公司，合格证号SCXK（湘）2015-0003。分笼饲养于湖南中医药大学实验动物中心，自由进食及饮水，实验室温度（22±2）℃，湿度60%～80%，人工光照约12 h明暗周期，定期消毒。

药物：雷公藤购于湖南省松龄堂中药饮片有限公司，批号：SL16041501，经湖南中医药大学张志国教授（湖南中医药大学附属一医院首届名医，教授，主任药师，学术传承博士生导师，现任中华中医药学会炮制分会副主任委员、湖南省中药专业委员会副主任委员）鉴定为卫矛科雷公藤属雷公藤的根及根茎。雷公藤提取物的制备：取一定量雷公藤加6倍量90%乙醇，加热蒸馏提取3次，1 h/次；取醇提残渣，加10倍量水，加热提取1 h；合并滤液，冷冻干燥制成粉末保存备用。

试剂与仪器：氯化镉（北京嘉世玉禾化工技术研究院，批号：S50144），羧甲基纤维素钠（CMC-Na，上海山浦化工，批号：20121222），水合氯醛（上海沪试，批号：20151217）；全自动生化分析仪（midray BS-300，迈瑞公司），TDZ4-WS台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），TP1020自动脱水机，RM2135型石蜡切片机，DM1000光学显微镜（均为德国LEICA公司），CS-VI型摊片烤片机（湖北孝感宏业医用仪器有限公司），Tissue-Tek TEL组织包埋机（日本SAKURA公司），隔水式电热恒温培养箱（上海市跃进医疗器械厂），微波炉（TCL有限公司），MiniSee图像采集系统。

1.2 方法

分组：参考文献和临床常用剂量等比设定4个雷公藤提取物（TWHF）剂量组（3.13、6.25、13.5、27.0 g生药/kg）。大鼠预养1周后，按体重大小编号，按随机数字表法将其随机分为6组，每组8只，分别为空白组（N组）、模型组（M组）、模型组+1倍剂量TWHF组（MD1组）、模型组+2倍剂量TWHF组（MD2组）、模型组+4倍剂量TWHF组（MD3组）、模型组+8倍剂量TWHF组（MD4组）。

造模：氯化镉造模剂量设定为3 mg/（kg·d），给药第4～7天，注射3次，造肾小管S1段和S2段损伤的急性肾衰模型，造模后大鼠体重减轻，尿量减少，最终通过肾脏病理切片证实造模成功。

给药：将TWHF溶于5%的CMC溶液，按上述剂量灌胃给药，N组灌以同体积的5% CMC溶液，每天给药1次，持续7 d，第8天处死大鼠。

常规指标观察：给药后观察大鼠毛色、饮食及行为活动等一般状况；分别在给药前及给药后第1、3、5、7天称量大鼠体重；并在给药前、造模后、处死前将大鼠放于代谢笼中，接取尿液，记录24 h尿量。

肾组织器官脏器系数：记录大鼠死亡率，将大鼠解剖后，摘取两肾，用滤纸吸干，称取重量。脏器系数=器官湿重/体重×100%。

生化指标测定：实验第8天，大鼠股动脉取血，室温放置2 h后离心（3000 r/s）10 min，得到的血清样本进行生化检测，主要有血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（CREA）、Ca2+、Na+、K+、Cl-。

肾脏病理组织形态学检查：实验结束后处死动物，解剖后用冰生理盐水洗血迹，滤纸吸尽表面水分，精确称重，将摘取的一侧肾脏立即固定于10%福尔马林中，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片厚3 μm，HE常规染色，并于光镜下观察组织病理变化情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，各组定量检测数据以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间比较采用LSD检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各組大鼠一般情况变化

各组动物中，N组大鼠精神状态良好，行动灵活，毛发光泽，两便正常；氯化镉造肾小管S1段和S2段损伤的急性肾衰模型后，M组大鼠表现出毛色无光泽，眼神黯淡，萎靡少动，饮食量减少。氯化镉造模前，大鼠体重整体水平呈现增长趋势；造模后，体重早期仍增长，但增长速度较N组减慢，至后期（第7天）体重甚至下降；与M组比较，MD1、MD2组早期大鼠体重稍有增长，后期仍明显下降。而MD3、MD4组体重增长抑制作用明显，后期体重下降更为明显，MD3、MD4组各出现1例小鼠死亡。见表1。

2.2 各组大鼠给药后肾脏脏器指数与24 h尿量变化情况

肾脏脏器指数：重铬酸钾造模后，与N组比较，M组肾脏脏器指数显著升高（P < 0.01）；给予不同剂量TWHF后，与M组比较，MD1、MD2组肾脏脏器指数有下降趋势，但未达到显著性，MD3、MD4组肾脏脏器指数进一步升高。见表2。

尿量：与N组比较，M组尿量明显减少，MD1、MD2组尿量减少较高剂量组缓慢，MD3、MD4组后期尿量减少更为明显；M组各组大鼠尿液出现红棕色，甚至血尿，部分动物出现死亡现象，尤以高剂量组明显，MD3、MD4组大鼠各死亡1只。见表2。

2.3 各组大鼠肾脏功能生化指标的比较

重铬酸钾造模后，与N组比较，M组大鼠BUN、CREA、K+浓度显著增高，Na+、Ca2+浓度明显降低；M组给予不同剂量TWHF后，与M组比较，MD1组大鼠BUN降低，CREA、K+浓度明显降低，Na+浓度无明显改变；MD2组大鼠BUN、K+浓度无明显改变，CREA水平显著降低，Ca2+浓度显著升高；MD3、MD4组大鼠BUN、CREA、K+、Ca2+浓度进一步增高，Na+浓度明显降低。见表3。提示雷公藤在正常大鼠上表现出剂量相关性的肾损伤，在肾小管S1和S2段损伤的急性肾衰模型大鼠上，低剂量TWHF表现出一定的保护作用，而高剂量加重肾损伤。

2.4 各组大鼠肾脏组织病理形态学

重铬酸钾造模后，M组大鼠肾脏组织结构镜下可见肾小管上皮细胞水肿颗粒样变性，肾小球系膜区增宽伴系膜基质增多、系膜细胞增生、毛细血管腔开放欠佳等病理改变。与M组比较，MD1、MD2组肾脏组织损伤有一定程度减轻，MD3、MD4组肾脏损伤进一步加重，严重者肾间质少量钙化，皮质区肾小球坏死、钙化，近皮质区域肾小球、肾小管坏死严重，髓质水肿。见图1（封四）。提示雷公藤低剂量在模型大鼠上表现出保护作用，高剂量表现出损伤作用。

3 讨论

雷公藤作为一种传统中草药，在中医学中有着悠久的药用历史。随着现代药理毒理学研究的不断深入和大量临床病例的报道，研究者发现雷公藤在拥有良好临床疗效的同时，其毒性作用和不良反应也不容忽视[10]。雷公藤在治疗肾脏疾病方面使用甚广，因而本文重点讨论雷公藤的肾脏毒性。

雷公藤在短期内用药时，其肾脏毒性往往不明显，但长期使用时，尤其是对于原本已有肾脏损伤的患者时，雷公藤潜在的肾毒性需要临床高度重视。本实验模拟了肾小管S1和S2段损伤时雷公藤的肾脏毒性。从实验结果看，在高剂量组，也就是4倍、8倍剂量TWHF时，小鼠的尿量明显减少，BUN、CREA均明显增高，电解质紊乱加重（高K+低Na+），肾脏脏器指数明显升高，并且随TWHF剂量增高，其肾脏的损伤明显加重。同时，在4倍、8倍剂量TWHF时，小鼠体重的增长明显减慢，且两组均出现1例小鼠死亡。从肾脏病理改变来看，高剂量组肾脏病理改变明显加重。说明雷公藤在高剂量时的肾脏损害还是非常明显的。但是在低剂量MD1、MD2组，即1倍、2倍剂量TWHF时，则表现出完全不一样的结果。小鼠的尿量与M组比较没有明显变化，BUN、CREA有所降低，尤其是两组CREA降低有显著意义；电解质紊乱情况也较模型组有所减轻；肾脏脏器指数无明显改变。同时小鼠体重的增长情况较模型组好转，MD1、MD2组小鼠体重高于同时期M组小鼠。从肾脏病理改变来看，低剂量组肾脏病理改变较M组有所好转，说明在低剂量时，雷公藤不仅不会加重肾脏损害，还对原有肾脏损害有治疗效果，这也在一定程度上说明了雷公藤在肾脏疾病方面的治疗效果。

雷公藤的免疫抑制作用主要通过以下途径实现：通过抑制T、B淋巴细胞的增殖活化，使活化的T细胞发生凋亡，抑制其进一步增殖；升高免疫细胞内环磷酸腺苷水平，减少白细胞介素2（IL-2）和免疫球蛋白的生成；抑制巨噬细胞杀伤活性；抑制树突状细胞的分化成熟、迁移、抗原呈递功能，诱导树突状细胞凋亡；下调前炎症细胞因子、趋化因子、黏附分子、炎症介质及基质金属蛋白酶。因而使其具有修复肾脏足细胞损伤、保护肾小管上皮细胞、促进肾脏系膜细胞及基质损伤的恢复等作用[11-14]。而雷公藤的肾脏毒性机制目前却不甚明了。雷公藤的肾毒性作用主要损及肾小管、肾间质，光镜下可见肾小管上皮细胞变性、萎缩、坏死，肾间质炎细胞浸润。往往先是肾脏皮层Sl受损伤，然后肾乳头受损伤，最后肾脏皮层S3段受到损伤[15]。

本实验观察到雷公藤这种低剂量治疗疾病，高剂量损伤机体的情况，与中药的“有故无殒”理论相符。“有故无殒”在中药毒理学方面的含义为：当机体患有疾病时（有邪气），药物用于治疗疾病（作用于病邪），表现出的是药物的治疗作用；而当药物作用于正常机体时，其毒性就会作用于机体[16]。

很多研究证实中药“有故无殒”的现象，其思想的实质是研究中药与特定症候或集体状态之间的对应关系及其内在的变化规律[17-20]。现代对雷公藤肾毒性的研究多关注其物质基础与作用机制对毒效关系的影响，而忽略了药物对不同状态的机体产生的毒性差异[21-24]。雷公藤对肾损伤病理状态较正常生理状态下的肾毒性低，在一定剂量范围内表现“有故无殒”，其安全用于临床治疗的前提之一是“对症”，提示临床用药时，需要把握不同病理状态的雷公藤的量-毒效差异，从而保证其用药的安全性。

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