大鼠正中视前核注射血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)对某些肾脏功能指标的影响*

栗 亮， 高 原

(1. 遵义医学院珠海校区生理学教研室， 广东 珠海 519090; 2. 枣庄职业学院医学院， 山东 枣庄 277800)

大鼠正中视前核注射血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)对某些肾脏功能指标的影响*

栗 亮1,2， 高 原1△

(1. 遵义医学院珠海校区生理学教研室， 广东 珠海 519090; 2. 枣庄职业学院医学院， 山东 枣庄 277800)

目的：探讨大鼠正中视前核注射血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)对某些肾脏功能指标的影响。方法：健康雄性SD大鼠56只随机分为4组(n=14):①人工脑脊液组：正中视前核(MnPO)先注射人工脑脊液(aCSF)0.25 μl，20 min后再注射0.25 μl，②血管紧张素Ⅱ组:MnPO先注射aCSF 0.25 μl，20 min后再注射内含20 ng血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)溶液0.25 μl，③洛沙坦预处理组：MnPO先注射内含5 μg洛沙坦(Losartan)溶液0.25 μl，20 min后再注射20 ng血管紧张素Ⅱ溶液0.25 μl，④洛沙坦组：MnPO先注射内含5 μg洛沙坦溶液0.25 μl，20 min后再注射aCSF 0.25 μl。每组取7只大鼠在注射前、注射后20 min、40 min、60 min、120 min检测尿钠浓度，另7只大鼠注射1 h后处死动物，取肾脏，检测各组大鼠肾组织一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性。结果：52只大鼠进入结果分析，与人工脑脊液组相比，血管紧张素Ⅱ组肾脏NO与NOS活性升高，1 h肾排钠量明显升高；与洛沙坦预处理组相比，血管紧张素Ⅱ组肾脏NO与NOS活性升高，1 h肾排钠量也明显升高。结论：AngⅡ作用于MnPO后，肾促钠排泄反应增强，肾皮质NO水平升高，NOS活性增强，洛沙坦预处理可下调AngⅡ在肾脏诱导的上述变化。

正中视前核；血管紧张素Ⅱ；一氧化氮；一氧化氮合酶；大鼠

MnPO； angiotensinⅡ； NO； NOS； rat

【DOI】 10.12047/j.cjap.5360.2017.009

水、电解质的中枢调节一直是一个重要的生理学问题。脑内的血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)可介导饮水行为、嗜钠、和排钠利尿等效应[1]。Pereira da Silva等在清醒大鼠观察到，在正中视前核(median preoptic nucleus, MnPO)微量注射AngⅡ，通过AT1介导，不仅诱发动物的饮水和嗜盐行为，而且引发显著的排钠利尿效应。但在正中视前核(median preoptic nucleus, MnPO)，由AT1受体介导的促钠排泄反应的途径与肾皮质一氧化氮(nitric oxide， NO)及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性变化的影响报道较少。

本文在麻醉大鼠的MnPO微量注射AngⅡ，或预先注射AT1受体拮抗剂洛沙坦(Losarten)后再注射AngⅡ，检测排钠反应和肾组织NO与NOS活性变化，试图探讨MnPO注射AngⅡ或洛沙坦对肾排钠量的影响。观察MnPO注射AngⅡ后肾组织NO与NOS活性变化。用洛沙坦阻断脑AT1受体后肾组织NO与NOS活性变化。

1 材料与方法

1.1 动物

56只雄性SD大鼠，体质量200～250 g，中山大学动物实验中心提供[动物使用合格证号SCXK(粤)2007-0011]。

1.2 药物与试剂

AngiotensinⅡ(美国Sigmag公司)；Losartan(美国默沙东公司)；一氧化氮检测试剂盒、一氧化氮合酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；尿钠试剂盒(上海沪震实业有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 实验分组 健康雄性SD大鼠56只随机分为4组(n=14):(1)人工脑脊液组:MnPO先注射人工脑脊液(artificial cerebro spinal fluid,aCSF)0.25 μl，20 min后再注射0.25 μl；(2)血管紧张素Ⅱ组:MnPO先注射aCSF 0.25 μl，20 min后再注射内含20 ng血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)溶液0.25 μl；(3)洛沙坦预处理组：MnPO先注射内含5 μg洛沙坦(Losartan)溶液0.25 μl，20 min后再注射20 ng血管紧张素Ⅱ溶液0.25 μl；(4)洛沙坦组：MnPO先注射内含5 μg洛沙坦溶液0.25 μl，20 min后再注射aCSF 0.25 μl。每组取7只大鼠在注射前、注射后20 min、40 min、60 min、120 min检测尿钠浓度，另7只大鼠注射1 h后处死动物，取肾脏，检测各组大鼠肾组织NO含量和NOS活性。aCSF(mmol/L)：NaCl 120，NaH2PO41.5，NaHCO326，MgSO41.4，KCl 4，CaCl21.5，葡萄糖10，溶于1 000 ml的重蒸水中，pH值调制7.4。

1.3.2 注射位点的确认 心脏显露，快速灌注50 ml生理盐水，后灌注多聚甲醛的固定液400 ml，随即剪下大鼠头，打开颅腔，固定鼠脑，连续振荡切片，克紫染色，脱水、透明、封固。判断注射位点(图1)，不准确抛弃。

1.3.3 尿钠浓度测定 麻醉，分离一侧颈外静脉，静滴补充丢失体液。分离另一侧颈总动脉插管，测定血压和心率。行双侧的输尿管插管收集尿液，待血压、心率稳定后，收集尿液1次，MnPO分别给药，注射后20 min、40 min、60 min、120 min收集尿液，按照说明书测定尿Na+含量。

1.3.4 一氧化氮和合酶活性测定 另外28只大鼠MnPO微量注射AngⅡ1 h后，取一肾，用眼科剪尽快剪碎组织块(在冰水浴中进行)。在玻璃匀浆器中进行研磨匀浆，低温低速离心机4℃，2 000 r/min离心10 min，按照说明书测定一氧化氮和合酶活性。

Fig. 1 Median preoptic nucleus histological sections Nissl image A: MnPO of coronal histological sections panograma map; B: Glass micro-tube was used of located in the MnPO,arrow pointing to the anchor point; MnPO: Median preoptic nucleus

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 注射位点的确认

观察切片，根据针道尖端位置判断注射位点(图1B)，弃去4只注射位点不准确大鼠，余52只大鼠进行实验。最终各组大鼠为aCSF组(n=12)、AngⅡ组(n=13)、洛沙坦预处理组(n=14)和洛沙坦组(n=13)。

2.2 MnPO注入AngⅡ对肾排钠的影响

aCSF组和洛沙坦组注射前与注射后120 min内排钠量基本平稳。AngⅡ组注射后21～40 min排钠量达到高峰，与aCSF组比较有统计学意义(P<0.05)。洛沙坦预处理组注射后21～40 min内的排钠量明显低于AngⅡ组(P<0.05)。洛沙坦预处理组注射后21-40 min内的排钠量仍高于aCSF组(P<0.05，表1)。

2.3 MnPO注入AngⅡ对肾组织NO水平及其合酶活性的影响

AngⅡ组肾皮质NO和NOS活性均明显高于人工脑脊液组(P<0.05，P<0.01)；洛沙坦预处理组肾皮质NO水平和NOS活性均明显低于AngⅡ组(P<0.01)；洛沙坦组肾皮质NO水平和NOS活性均明显低于AngⅡ组(P<0.01)；但洛沙坦预处理与洛沙坦比较，肾皮质NO和NOS水平无明显差异(表2)。

GroupnBefore1～20min21～40min41～60min61～120minA61.23±0.681.31±0.461.24±0.511.29±0.491.30±0.53B61.27±0.573.01±0.434.78±0.56*2.41±0.521.35±0.48C71.37±0.521.65±0.412.43±0.76#2.02±0.471.32±0.51D61.28±0.601.29±0.371.32±0.53#1.30±0.461.29±0.49

A： aCSF group； B： AngⅡgroup； C： Losartan pretreatment group； D： Losartan group; aCSF: Artificial cerebro spinal fluid

*P<0.05vsA group;##P<0.05vsB group

GroupnNO(μmol/g)NOS(u/mg.prot)A60.96±0.170.21±0.19B71.39±0.20**0.25±0.20*C71.06±0.19##0.21±0.23##D71.10±0.17##0.20±0.17##

A: aCSF group; B: AngⅡgroup; C: Losartanpretrea tment group; D: Losartan group; NO: Nitric oxide; NOS: Nitricoxide synthase; aCSF: Artificial cerebro spinal fluid

*P<0.05,**P<0.01vsA group;###P<0.01vsB group

3 讨论

MnP0位于第三脑室的前壁,与调节水、电解质平衡的终板血管器、室旁核、视上核等核团有密切联系[2，3]。脑内存在独立的肾素-血管紧张素系统；该系统可以诱发动物的嗜盐、饮水行为，还有排钠利尿效应，因此中枢的AngⅡ在水、盐平衡的调节中具有重要的作用[4]。本实验也观察到大鼠MnPO注射AngⅡ引起显著的促钠排泄反应，给予洛沙坦可减轻排钠反应。提示脑内AT1受体可能参与AngⅡ刺激引起的促钠排泄反应。

同时本实验观察到MnPO注射AngⅡ后1 h，肾皮质NO含量升高及其合酶活性明显增强，表明MnPO注射AngⅡ可增强肾NO含量及其合酶活性。Pablo报道在肾动脉使用NO可增加尿钠浓度[5]，提示肾脏的NO及其合酶可能参与脑内AngⅡ引发的肾脏排钠反应。本实验还发现洛沙坦预处理后明显降低了脑内MnPO部位注射AngⅡ引发的肾脏NO水平及其合酶活性，提示脑血管紧张素能AT1受体参与了MnPO注射AngⅡ引起的促钠排泄反应。在人类，肾小管上皮细胞在含AngⅡ的细胞液内被孵育，可能是通过增加环磷酸鸟苷水平这一机制使一氧化氮随时间一剂量依赖性的增加释放。基于上述事实，我们推测MnPO注射AngⅡ与脑血管紧张素能AT1受体相结合，通过某种神经体液机制激活了肾皮质内的NOS，使NO合成增多，促进肾排钠反应。

Linas and Repine[6]观察原代培养的鼠肾近端小管上皮细胞中，由上皮细胞产生的NO抑制了基底膜的钠流和钠泵的活性，Liang and Knox[7]发现在从负鼠肾细胞分离的囊泡中加入硝普盐(外源性NO供体)能够降低钠泵活性。在髓袢升支粗段细胞系，NO通过限制Na+泵α1-亚单位的基因表达降低Na+泵的活性[8]。在远端肾单位，NO可直接抑制集合管对钠的重吸收和水的渗透[8]。给人类肾灌注L-精氨酸(NO的前体)可以使NO合成增多，尿钠排泄也增多。因此结合本实验推测肾小管上皮细胞能够合成NO，激活鸟苷酸环化酶，提高环磷酸鸟苷水平[9]，进而抑制近曲小管上皮细胞Na+泵活性[5]，减少NaCl的重吸收，尿钠增多。

一氧化氮及其合酶参与肾排钠排水的机制很复杂，还可能有中枢或(和)外周其他物质参与，具体的生理机制还有待进一步的研究。

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国家自然科学基金资助项目(31160214)

2015-09-10 【修回日期】2016-06-20

R363

A

1000-6834(2017)01-037-03

△【通讯作者】Tel： 13326620969； E-mail： gy60211@aliyun.com