有氧运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌ERK1/2活性的影响*

李艳辉， 衣雪洁

(沈阳体育学院 运动人体科学学院， 辽宁 沈阳 110102)

有氧运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌ERK1/2活性的影响*

李艳辉， 衣雪洁△

(沈阳体育学院 运动人体科学学院， 辽宁 沈阳 110102)

目的：观察有氧运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌细胞外信号调节激酶(ERK1/2)活性的影响，探讨有氧运动对2型糖尿病的预防和调控机制。方法：将75只SD大鼠随机分为正常对照组(CON)、糖尿病对照1组(DC1)、糖尿病运动1组(DE1)、糖尿病对照2组(DC2)、糖尿病运动2组(DE2) 5组(n=15)。正常对照组用普通饲料喂养，糖尿病组用高脂高糖配方饲料喂养。经过8周高脂高糖喂养后，糖尿病2组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)，诱发2型糖尿病；糖尿病运动1组游泳的最后1周初和糖尿病对照1组同时注射STZ，注射剂量为35 mg/kg，3 d后尾部取血测血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。运动干预8周后，测定大鼠血清胰岛素、骨骼肌中ERK1/2蛋白表达等指标。结果：①与正常对照组比较，糖尿病各对照组血液中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)显著升高(P<0.05,P<0.01)，空腹血糖(FBG)、胰岛素(FIN)含量和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著升高(P<0.01)，ERK1/2磷酸化的蛋白表达显著下降(P<0.05)，糖尿病对照2组ERK1/2蛋白含量显著下降(P<0.05)；②8周游泳运动后，与糖尿病对照组比较，糖尿病运动组血液中TC、TG、FFA、LDL-C显著下降(P<0.05)，FBG、FIN、HOMA-IR显著下降(P<0.05，P<0.01)， ERK1/2磷酸化蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论：长时间有氧运动，增加了骨骼肌ERK1/2磷酸化水平，改善了2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的状况，降低血糖。这可能是改善糖代谢紊乱，提高胰岛素敏感性的机制之一。

有氧运动；胰岛素抵抗；2型糖尿病；ERK1/2

【DOI】 10.12047/j.cjap.5347.2017.008

随着人民生活水平的提高，人们的饮食结构发生了巨大变化，饮食中脂肪和糖的含量不断增加，同时体力劳动减少，导致能量摄入增加，消耗减少，使机体长期处于能量的正平衡状态，引发了许多现代文明病：如肥胖、糖尿病、高血压、高脂血症等，严重威胁着现代人的生命。特别是糖尿病的发病率逐年上升，其中2型糖尿病病人占全部糖尿病人的90%以上。这种疾病的主要特征是胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能衰竭和胰岛素分泌相对不足，而胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要发病机制[1]。目前研究证实，在正常骨骼肌细胞中，胰岛素与受体结合后的生理效应是通过磷脂酰肌醇-3激酶PI-3K途径和细胞丝裂素原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKS)途径传导的。而在2型糖尿病骨骼肌细胞中，胰岛素信号传导通路中多个信号蛋白往往表现出胰岛素刺激的活性受损，并伴有骨骼肌对葡萄糖摄取的减少。胰岛素受体后信号传导异常涉及到多种与胰岛素作用相关的酶或蛋白质，还有一些细胞内的信号传导蛋白以及效应蛋白。如：胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、胰岛素受体底物-2(insulin receptor substrate-2, IRS-2)、磷脂酰肌醇-3激酶 (phosphatidylinositol 3 kinase, PI-3K)、细胞外信号调节激(extracellular regulated protein kinases,ERK)、葡萄糖转运蛋白(glucose transporter,GLUT)等重要的信号分子[2]。

研究表明[3，4]，长期有氧运动可以促进胰岛素与受体结合，通过增加受体后胰岛素信号通路中细胞外信号调节激酶ERK1/2的活性，改善其磷酸化水平，促进ERK1/2蛋白和基因表达，增加胰岛素的敏感性，促进葡萄糖吸收，调节血糖平衡。本研究利用现代分子生物学技术，以饮食和药物诱导大鼠建立2型糖尿病动物模型，主要围绕ERK1/2活性与血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数的关系，进一步探讨有氧运动对ERK1/2活性的影响，揭示有氧运动改善2型糖尿病骨骼肌糖代谢和糖转运的分子机制, 更有效地指导运动疗法在临床上的应用，为糖尿病的治疗和预防提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验方法

1.1.1 糖尿病动物造模和分组干预 选用10月龄雌性SD大鼠75只随机分为：正常对照组(CON)、糖尿病对照1组(DC1)、糖尿病运动1组(DE1)、糖尿病对照2组(DC2)、糖尿病运动2组(DE2)(n=15)。正常对照组一直用普通饲料喂养，糖尿病组8周高脂高糖饲料(鸡蛋10%、猪油20%、盐1.5%、糖9.5%、基础饲料59%)喂养后，糖尿病2组先腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)，由Sigma公司提供。然后糖尿病运动2组进行8周的游泳运动。糖尿病运动1组先进行8周的游泳运动，游泳的最后1周初和糖尿病对照1组同时注射STZ。注射剂量为35 mg/kg，3 d后尾部取血测血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。造模后糖尿病组大鼠继续高脂高糖饲料喂养。运动组采取游泳运动(6次/周，每周休息1 d，持续8周)，水温32℃～36℃。动物泳池水深50 cm，第1、2天先试游10 min，后逐渐加量，前两周每天游45 min，最后按照10 min/40 g确定每组大鼠游泳时间。

1.1.2 取材 末次运动结束后，所有大鼠禁食12 h取材，腹腔注射氨基甲酸乙酯麻醉，麻醉后尾部取血离心制备血清，待测血脂、空腹血糖和空腹胰岛素。然后迅速分离肾周、肠系等内脏组织脂肪。分离腓肠肌，密封于-80℃深冻冰箱保存，待测骨骼肌ERK1/2的蛋白表达。

1.1.3 指标测定 (1)体重和脂肪组织重量：用电子天平准确称量。(2)血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterin,LDL-C)的测定：试剂由中生北控生物科技股份有限公司提供，用MD-100半自动生化分析仪测定。(3)血清游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)的测定：采用铜显色法测定，试剂由南京建成生物工程研究所提供。(4)空腹血糖测定：用湖南三诺血糖仪测定。(5)血清胰岛素的测定：采用放射免疫法测定，试剂由北京中国原子能科学研究院同位素研究所提供。(6)骨骼肌ERK蛋白表达的测定：Western blot印迹分析方法，最后采用凝胶成像分析软件进行图像光密度值分析，以β-action为内参。用待测蛋白的光密度值与内参光密度值之比表示待测蛋白的相对表达水平。以上实验均在沈阳体育学院国家体育总局冬季运动项目技术诊断与机能评定重点实验室完成。

1.2 数据处理

2 结果

2.1 各组大鼠体重、脂肪量和脂体比的变化情况

2.1.1 实验前和8周高糖饲料喂养后的体重状况 经过8周的高糖高脂饲料喂养后，与正常对照组相比，糖尿病组体重显著升高。根据肥胖的标准，糖尿病组体重均高于正常对照组体重的20%以上，达到了肥胖(P<0.01，表1)。

GroupBW(g)AEWBW(g)CON262.45±7.83264.70±8.63DC1263.38±9.21341.67±43.78**DE1267.54±6.39348.36±51.92**DC2265.34±8.32341.45±17.58**DE2264.25±9.76338.56±27.96**

CON: Normal control group; DC1: Diabetes control group 1; DE1: Diabetes exercise group 1; DC2: Diabetes control group 2; DE2: Diabetes exercise group2; BW: Body weight; AEWBW: Body weight after eight weeks’ feed

**P<0.01vsCON group

2.1.2 实验结束时各组大鼠体重、脂肪量和脂体比的变化情况 糖尿病1组大鼠与正常对照组相比，体重、脂肪量和脂体比显著升高(P<0.05，P<0.01)，糖尿病2组大鼠与正常对照组相比，体重、脂肪量和脂体比有升高的趋势，但无统计学意义；糖尿病运动组与对应糖尿病对照组相比，体重有增加的趋势，脂肪量、脂体比有减少的趋势，但无统计学意义(表2)。

GroupBW(g)FPW(g)FPW/BW(%)CON260.50±11.0112.16±3.224.65±1.15DC1306.67±43.78**35.98±3.98*11.70±3.31**DE1340.36±51.92**34.69±8.78*10.09±2.43**DC2280.17±61.7521.09±5.107.51±1.16DE2287.00±33.6219.51±3.776.76±1.11

BW: Body weight; FPW: Fat pad weight; FPW/BW: Fat pad weight/body weight

*P<0.05，**P<0.01vsCON group

2.2 各组大鼠血脂的变化情况

实验结束时，糖尿病各对照组大鼠血液中TG、TC、LDL-C、FFA含量都显著高于正常对照组(P<0.05,P<0.01)，糖尿病各运动组与其相对的对照组比较，TG、TC、LDL-C和FFA都显著性降低(P<0.05，表3)。

2.3 各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素和胰岛素抵抗指数的变化情况

实验结束时，糖尿病各对照组大鼠空腹血糖(fasting blood-glucose, FBG)浓度、空腹胰岛素(fasting insulin, FIN)浓度、胰岛素抵抗指数(insulin resistance index, HOMA-IR)都显著高于正常对照组(P<0.01)。糖尿病运动组与其对应的糖尿病对照组比较，FBG浓度、FIN 浓度、HOMA-IR都显著降低(P<0.05，P<0.01，表4)。

2.4 各组大鼠骨骼肌ERK1/2蛋白表达及磷酸化水平情况

与正常对照组比较，糖尿病各对照组ERK1/2磷酸化蛋白含量显著降低(P<0.05)，糖尿病对照1组ERK1/2蛋白含量降低，但无统计学意义，糖尿病对照2组ERK1/2蛋白含量降低(P<0.05)。糖尿病运动组与对应的糖尿病对照组比较，ERK1/2磷酸化蛋白含量显著升高(P<0.05)，ERK1/2蛋白含量升高，但无统计学意义(表5)。

GroupTGTCLDL-CFFACON0.34±0.070.87±0.170.30±0.060.75±0.16DC11.06±0.25**1.20±0.22**0.38±0.01*1.51±0.24**DE10.62±0.18#0.94±0.11#0.31±0.06#0.88±0.11#DC21.07±0.11**1.32±0.07**0.40±0.02*1.57±0.12**DE20.86±0.26△1.03±0.11△0.31±0.03△1.17±0.25△

TG: Triglyceride; TC: Total cholesterol; LDL-C: Low density lipoprotein cholesterin; FFA: Free fatty acid

*P<0.05,**P<0.01vsCON group;##P<0.05vsDC1 group;#△P<0.05vsDC2 group

GroupFBG(mmol/l)FIN(uIU/ml)HOMA-IRCON4.76±0.4440.94±13.298.65±1.25DC114.53±4.92**68.76±14.40**44.40±9.22**DE19.36±4.93#43.17±10.52#17.96±8.54##DC219.94±2.13**77.42±16.06**68.61±21.63**DE211.38±6.66△49.88±14.93△25.23±9.81△△

FBG: Fasting blood-glucose; FIN: Fasting insulin; HOMA-IR: Insulin resistance index

**P<0.01vsCON group,##P<0.05,##P<0.01vsDC1 group;#△P<0.05,△△P<0.01vsDC2 group

GroupP-ERK1P-ERK2T-ERK1T-ERK2CON10.70±1.3214.28±1.1217.43±2.3619.48±2.36DC18.56±0.72*10.78±0.84*16.72±1.1217.25±1.32DE19.92±0.56#12.34±0.92#17.08±1.4219.34±2.01DC28.09±0.78*10.02±0.73*14.45±1.02*16.56±1.78*DE29.32±0.67△11.87±0.89△15.92±1.3418.79±1.92

P-ERK1/2: ERK1/2 protein phosphorylation level; T-ERK1/2: ERK1/2 total protein level

*P<0.05vsCON group;##P<0.05vsDC1 group;#△P<0.05vsDC2 group

3 讨论

2型糖尿病常伴有脂代谢紊乱，其典型表现为血清TG及FFA增高。运动是预防和治疗2型糖尿病最基本的措施之一。运动时脂肪动员加强，脂肪组织中脂蛋白脂肪酶(LPL)和血浆中的LPL水平升高，使TG和富含TG的脂蛋白代谢加速，水解产生FFA供能，最终血浆中TG水平下降，同时由于肌肉储存的TG被消耗，继而减轻TG对骨骼肌细胞及胰岛细胞的毒性作用[5]。本研究在糖尿病造模前、后分别施加了8周的有氧运动干预，两组干预后血清TG和FFA均显著低于其对照组，提示运动在糖尿病发生前后均可有效的改善脂质代谢紊乱。推测其原因可能是：有氧运动加速了脂肪组织的动员和分解，促进了游离脂肪酸和胆固醇的利用，从而降低了血脂。另外大量的脂肪消耗也起到了减肥作用，减轻了胰岛的负担。

本研究结果显示，糖尿病对照1组和对照2组大鼠空腹血糖浓度、胰岛素浓度显著高于正常对照组，在糖尿病造模的前、后分别施加8周的有氧运动，糖尿病运动组大鼠空腹血糖浓度、胰岛素浓度均显著降低，说明有氧运动能够降低血糖浓度，增加胰岛素的敏感性。

胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要发病机制，主要表现为胰岛素抑制肝释放葡萄糖和促进周围组织利用葡萄糖的能力下降，为了调节血糖平衡，机体代偿性分泌过多胰岛素，即高胰岛素血症，从而导致机体一系列病理生理变化[6]。本研究提示运动能够有效改善胰岛素抵抗，提高胰岛素的敏感性。运动能够改善胰岛素抵抗和提高胰岛素的敏感性可能是因为运动增加了外周组织的血液循环，促使胰岛素与受体接触的几率增加，受体结合量增加，受体后作用得到改善，从而减少了胰岛素抵抗，胰岛素的敏感性增加。

目前在真核细胞中确定出的MAPK信号转导途径有四条：细胞外信号调节的蛋白激酶1/2(ERK1/2)途径、p38途径、JNK途径和ERK5途径,这些途径对基因转录、细胞肥大、糖代谢、炎症和细胞凋亡等均有调节作用[7，8]。细胞外调节蛋白激酶 (ERK)分为 ERK1和ERK2，统称为 ERK1/2，分子量分别为42 kD和44 kD，主要被各种生长因子或分化信号如细胞因子、胰岛素、神经递质、生长或神经营养因子等磷酸化而激活，进入细胞核促进某些基因的转录与表达，和细胞的增殖与分化密切相关[9]。研究已证实，ERK1/2通路参与了骨骼肌中胰岛素的信号传递，调节葡萄糖转运和糖原代谢[10，11]。目前关于糖尿病大鼠骨骼肌中ERK1/2活性的研究并不多，吴毅等人[12]发现，在2型糖尿病大鼠骨骼肌中ERK1/2基础活性下降，与此同时并伴有肌肉组织对胰岛素敏感性降低和血糖水平的增高。Osmann等对肥胖Zucker大鼠进行研究发现，肥胖大鼠骨骼肌中基础的和胰岛素刺激的ERK2活性均明显降低[13]。但这方面的研究并不完全一致，可能与动物模型、运动时间、运动方式和取材时间的选择有关[14]。本研究结果显示，糖尿病对照1组和对照2组与正常对照组比较ERK1/2磷酸化蛋白含量显著降低，结合众多学者的研究，这表明在2型糖尿病大鼠骨骼肌中ERK1/2基础活性降低，导致ERK1/2介导的胰岛素信号传导障碍，胰岛素敏感性下降。

Goodyear[15]等首次提出了运动对大鼠骨骼肌细胞 ERK1/2、JNK和p38 信号分子有激活作用。曹师承等人[16]也提出，耐力运动后正常大鼠骨骼肌中ERK、p38MAPK、c-JNK等及下游信号分子的活性均可出现不同程度的升高。有研究还提出[3]，对大鼠骨骼肌进行体外收缩、原位收缩、机械拉伸等刺激及大鼠、小鼠分别进行跑台训练均能使其骨骼肌细胞ERK1/2被激活。本研究显示：在糖尿病造模的前、后分别施加了8周的有氧运动干预均可有效的升高骨骼肌ERK1/2磷酸化蛋白含量、并且运动后骨骼肌ERK1/2活性的增加与血清胰岛素下降、胰岛素敏感性增加和空腹血糖下降相一致。说明有氧运动可使糖尿病大鼠肌肉组织的ERK1/2活性增强，ERK1/2活性的增强从而增加了骨骼肌对葡萄糖的摄取、糖原的合成以及胰岛素敏感性，进而血糖降低。推测其机制可能是磷酸化的ERK1/2进入细胞核促进了GLUT4的转录和表达，增加了GLUT4的转位和激活，从而增加葡萄糖的转运与摄取和肌肉对糖的储存能力，进而血糖降低。

综上所述本研究通过高脂高糖饮食和注射少量链脲佐菌素诱导，可使大鼠出现胰岛素的敏感性下降，即出现胰岛素抵抗的2型糖尿病模型，同时出现糖、脂代谢紊乱,骨骼肌ERK1/2活性下降，推测其机制与骨骼肌ERK1/2活性降低有关。另外通过长时间有氧运动，改善了2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的状况，增加了骨骼肌ERK1/2磷酸化水平,提高了胰岛素敏感性，从而降低血糖。这可能是改善糖代谢紊乱,提高胰岛素敏感性的机制之一。

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The effects of aerobic exercise on ERK1/2 activity in skeletal muscle of type 2 diabetic rats

LI Yan-hui， YI Xue-jie△

(School of Sports Science， Shenyang Sport University， Shenyang 110102， China)

Objective: To observe the effects of aerobic exercise on activity of extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) in skeletal muscle of type 2 diabetic rats and explore the prevention and control mechanism of aerobic exercise on type 2 diabetes. Methods: Seventy five SD rats were randomly divided into: normal control group(CON) including 15 rats was fed with normal diet, diabetes control group 1(DC1), diabetes exercise group 1(DE1), diabetes control group 2(DC2), diabetes exercise group 2(DE2). Diabetes model group were fed with high-fatty and high-sugar diet. The diabetes model rats were fed with high-fatty and high-sugar diet for 8 weeks，.Diabetes group 2 rats were injected intraperitoneal streptozotocin(STZ)to induce type 2 diabetes. At the early stage of last swimming week, diabetes exercise group1 and diabetes control group 1 were injected with STZ (35 mg/kg) at the same time, After three days, if the level of blood glucose was ≥16.7mmol/L, the model was successful. After 8 week-interventions, all the rats were killed, the serum levels of insulin and the expression of ERK1/2 protein in skeletal muscle were determined. Results: ①Compared with the normal control group, the levels of total cholesterol(TC), triglyceride(TG), low density lipoprotein cholesterin(LDL-C), free fatty acid(FFA), fasting blood-glucose(FBG), fasting insulin(FIN) and insulin resistance index(HOMA-IR) were increased significantly in diabetes control group(P<0.05 or 0.01). However, the expression of ERK1/2 phosphorylation protein was decreased obviously in diabetes control group. The content of ERK1/2 protein was decreased obviously in diabetes control group 2 had (P<0.05). 2.After eight weeks' swimming, compared with the diabetes control group, the levels of TC,TG, FFA, LDL-C, FBG, FIN and HOMA-IR were decreased significantly in diabetes exercise group(P<0.05 or 0.01). At the same time, the expression of ERK1/2 phosphorylation protein was increased obviously in diabetes exercise group(P<0.05). Conclusion: Long-term aerobic exercise can improve the skeletal muscle ERK1/2 phosphorylation and insulin resistance of type 2 diabetic rats, thereby lowering blood glucose. It is probably one of the mechanisms to improve glucose metabolism disorders and insulin sensitivity.

aerobic exercise; insulin resistance; type 2 diabetes; ERK1/2

辽宁省优秀人才支持计划项目(WR2013015)；沈阳体育学院重点学科建设项目(XKFX1511)

2015-09-06 【修回日期】2016-06-17

G804.7

A

1000-6834(2017)01-033-05

△【通讯作者】Tel： 024-89166365； E-mail： yixuejie8387@163.com