长链非编码RNA SPRY4-IT1对髓母细胞瘤增殖及侵袭转移的影响*

史鹏飞， 吉海龙， 罗永康， 毛天明， 陈 茜， 周开宇△

(1． 温州医科大学附属第一临床医学院， 浙江温州 325000； 2. 浙江省台州市立医院神经外科， 3. 病理科， 台州 318000)

长链非编码RNA SPRY4-IT1对髓母细胞瘤增殖及侵袭转移的影响*

史鹏飞1， 吉海龙2， 罗永康2， 毛天明2， 陈 茜3， 周开宇1△

(1． 温州医科大学附属第一临床医学院， 浙江温州 325000； 2. 浙江省台州市立医院神经外科， 3. 病理科， 台州 318000)

目的：探讨长链非编码RNA SPRY4-IT1(LncRNA)对髓母细胞瘤增殖及侵袭转移的影响。方法：髓母细胞瘤Daoy细胞分为对照组和si-SPRY4-IT1组，分别利用脂质体Lipofectamine 2000将阴性对照荧光序列和SPRY4-IT1-siRNA转入细胞中，采用Real-time PCR检测转染后各组细胞中SPRY4-IT1的表达情况，CCK-8实验及平板克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化，以细胞体外侵袭、迁移实验分别检测细胞侵袭、迁移能力的变化,Western blot检测SPRY4-IT1对基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白的影响。结果：si-SPRY4-IT1组SPRY4-IT1 mRNA表达水平、细胞体外增殖能力、细胞侵袭、迁移能力、细胞MMP-2蛋白表达均较对照组明显降低(P<0.05)，而MMP-9蛋白表达未见明显变化。结论：干扰长链非编码RNA SPRY4-IT1在髓母细胞瘤Daoy细胞中的表达能显著抑制细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

髓母细胞瘤；长链非编码RNA(LncRNA)；SPRY4-IT1；增殖；侵袭迁移

【DOI】 10.12047/j.cjap.5441.2017.020

髓母细胞瘤是儿童小脑最常见的侵袭性胚胎性肿瘤,约占儿童小脑肿瘤的40%，颅内肿瘤的20%[1]。由于髓母细胞瘤对放、化疗敏感,肿瘤手术切除后行放、化疗仍是髓母细胞瘤主要的治疗方法,但过度放、化疗对儿童听力、认知能力、内分泌及血管系统造成严重损害并有继发性恶性肿瘤的副作用,肿瘤远期生存率及生活质量较差[2，3]，5年无进展长期生存率不到70%[4]。因此，深入探讨髓母细胞瘤发生发展的分子机制对髓母细胞瘤的早期诊治及改善预后具有重要意

义。

在真核生物体内存在着大量的无编码蛋白能力的RNA，这些不具有编码蛋白能力的RNA中其核苷酸链长度>200 nt为长链非编码RNA[5](long non-coding RNA，LncRNA)。近年来关于LncRNA的研究进展迅速，SPRY4-IT1(基因号AK024556)作为LncRNA家族的一员也受到越来越多的关注，其在胶质瘤中高表达与胶质瘤细胞的增殖、迁移密切相关[6]，但SPRY4-IT1是否在髓母细胞瘤中也发挥着相似作用，目前尚未见相关报道。本研究旨在体外观察SPRY4-IT1对髓母细胞瘤生物学功能的影响，为其用于临床治疗髓母细胞瘤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

髓母细胞瘤Daoy细胞购自美国ATCC公司；siRNA(小干扰RNA序列为sense:GCUUUCUGAUUCCAAGGCCUAUUAA；Antisense：UUAAUAGGCCUUGGAAUCAGAAAGC)由上海生工公司合成；Lipofectamine 2000和RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen公司；胎牛血清、DMEM培养基、OptiMate及磷酸盐缓冲液(PBS)(Gibco)公司；Real Master Mix(SYBR Green)实时荧光定量PCR试剂盒、cDNA第1链合成试剂盒均(北京天根生化科技有限公司)；CCK-8试剂(日本同仁公司)；Transwell小室(3422，孔径8.0 μm，直径6.5 mm)(Corning公司)；Matrigel Basement Membrane Matrix (美国BD公司)；兔抗人MMP-2抗体(货号ab37150)、MMP-9抗体(货号ab38898)(abcam公司)；兔抗人GAPDH抗体(杭州贤至生物科技有限公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(北京索来宝生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养及转染

髓母细胞瘤Daoy细胞培养于含10%胎牛血清(10% FBS)、1% 青霉素-链霉素混合液的DMEM培养基中,置37℃、5%CO2恒温培养箱培养,根据具体情况换液,常规消化、传代，取对数生长期细胞接种于6孔板中。待细胞贴壁且融合度达到80%～90%时,将阴性对照荧光序列及SPRY4-IT1-siRNA分别由Lipofectamine 2000转染入细胞，并分别标定为对照组和si-SPRY4-IT1组，具体操作为：取5 μl的Lipofectamine 2000和SPRY4-IT1-siRNA分别加入250 μl的OptiMate中并轻轻混匀，室温静置5 min后将两种溶液混合，轻轻混匀后室温静置20 min；将6孔板中细胞常温PBS漂洗2次，加入Lipofectamine 2000和SPRY4-IT1-siRNA混合液500 μl，并补足总体积为2 ml。阴性对照荧光序列转染与SPRY4-IT1-siRNA转染同时进行，过程全程避光，用锡箔纸包裹后置37℃、5% CO2恒温培养箱孵育6 h，随后弃转染液，PBS冲洗3～4次，更换正常DMEM培养基后荧光显微镜下观察转染效率并继续培养。

1.3 荧光定量PCR检测SPRY4-IT1表达量

收集转染后24 h的各组髓母细胞瘤Daoy细胞,预冷的PBS漂洗2次，按TRIzol试剂说明书提取总RNA，并用紫外分光光度计测定其A260/A280，比值在1.8～2.1之间为符合纯度要求。根据第1链合成试剂盒说明书将提取各组RNA分别逆转录合成cDNA,以GAPDH为内参,依照荧光定量PCR试剂盒说明书配置8连管每孔20 μl反应体系，每个标本设3个副孔，进行荧光定量PCR扩增，具体操作程序为：首先配制反应液：2×SuperReal PreMix Plus10 μl,正向引物0.5 μl,反向引物0.5 μl，cDNA模板2 μl，50×ROX Reference Dye 2 μl，然后加RNase-free ddH2O至20 μl。PCR反应初始变性温度为95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 25 s,70℃延伸25 s，40个循环。采用 2-ΔΔCt法计算每组相对表达量。引物序列如表1，均由上海生工公司合成。

Tab. 1 The sequence of SPRY4-IT 1 and GAPDH

1.4 CCK-8检测细胞增殖

将对数期的髓母细胞瘤Daoy细胞制成2×104cells/ml细胞悬液，取细胞悬液100 μl接种于96孔板中。细胞融合度达30%～50%时，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染，对照组和si-SPRY4-IT1组每组设3个复孔，将转染后时间设为0 h，转染6 h后更换96孔板中的培养基，放入37℃、5%CO2恒温培养箱中继续培养。CCK-8实验分别在转染0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后进行。实验前更换新的DMEM培养基，每孔加入10 μl CCK-8试剂，置于37℃、5%CO2恒温培养箱孵育3 h，平板震荡器上震荡10 s，于酶标仪上测对照组和si-SPRY4-IT1组细胞在450 nm处的吸光度。

1.5 平板克隆形成实验

将转染48 h后的对照组和si-SPRY4-IT1组细胞用PBS漂洗2次，用胰酶消化并制成细胞悬液，分别以200 cells/well接种于6孔板中，补足总体积2 ml并根据具体情况换液，2周后出现肉眼可见克隆时终止实验。吸去培养液，PBS轻轻漂洗3次，4℃冰箱内无水甲醇溶液固定20 min,0.1%结晶紫常温下染色10 min后计数克隆数，显微镜下计算大于50个细胞的克隆数，算出克隆形成率，克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.6 细胞体外侵袭实验

将Matrigel从-20℃取出，4℃解冻后置于冰上，用无血清DMEM培养基将matrigel稀释至50 mg/L，按每孔50 μl加入Transwell小室的上室，超净台内风干过夜。使用前每孔加入100 μl含1%牛血清白蛋白(1%BSA)的无血清DMEM培养液，37℃静置1 h后吸去小室内液体备用。Transwell小室杯孔直径为6.5 mm，杯底由聚碳酸脂微孔滤膜封闭(微孔孔径为8 μm)。用无血清DMEM培养液重悬转染后的各组细胞，制成浓度为3×105cells/ml的细胞悬液，分别取200 μl接种于Transwell小室的上室，下室为500 μl含有10%胎牛血清的DMEM培养基，每组3个复孔。放入37℃、5%CO2恒温培养箱培养24 h后取出，用棉签擦掉上层细胞，0.6 ml无水甲醇溶液于4℃冰箱中固定20 min，0.1%结晶紫常温下染色10 min，PBS冲洗4～5次。倒置显微镜×100视野下随机选取5个视野拍照并计数，最终以穿膜细胞的数目代表髓母细胞瘤Daoy细胞的侵袭能力。

1.7 细胞体外迁移实验

实验中，transwell小室上面无Matrigel包被，穿膜时间为24 h，其余操作与细胞侵袭实验相同，倒置显微镜×100视野下随机选取5个视野拍照并计数，最终以穿膜细胞的数目代表髓母细胞瘤Daoy细胞的迁移能力。侵袭、迁移抑制率(%)=(1-实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数)×100%。

1.8 Western blot

收集转染72 h后的6孔板内对照组和si-SPRY4-IT1组髓母细胞瘤Daoy细胞，1.5 ml离心管中1 200 r/min离心3min，弃上清液，加1ml PBS吹打均匀，1 200 r/min离心3 min，弃上清液后PBS重复洗涤1次。对照组和si-SPRY4-IT1组各加入200 μl预冷的RIPA裂解液，置于冰上20 min使其充分裂解细胞。将细胞裂解液转移至1.5 ml EP管中，4℃，12 000 r/min离心5 min，取上清，用BCA法检测蛋白浓度。于样品中加入5×SDS凝胶电泳上样缓冲液，100℃变性10 min。制作10%分离胶和5%浓缩胶的SDS -聚丙烯酰胺凝胶，每个槽孔取30 μg蛋白上样，凝胶电泳分离后湿转至PVDF上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL发光液反应5 min，置于曝光仪中进行检测。

1.9 统计分析

2 结果

2.1 si-SPRY4-IT1转染效率检测

Lipofectamine 2000转染阴性对照荧光序列6 h后，吸去6孔板内培养基并用PBS冲洗3～4次，100×荧光显微镜下可见到细胞出现绿色荧光。随机选择同一视野下的白光与荧光区域，比较每个区域的细胞数并拍照，以荧光下细胞数/白光下细胞数表示转染效率。本实验转染效率高达90%(图1)。

Fig. 1 Effective of control fluorescence siRNA were transfected into medulloblastoma cell line Daoy by Lipofectamine 2000 up a: Ordinary； b： Fluorescence ×100

2.2 si-SPRY4-IT1干扰效果检测

提取转染后24 h的各组髓母细胞瘤Daoy细胞RNA,逆转录合成cDNA，荧光定量PCR检测各组SPRY4-IT1表达量。si-SPRY4-IT1组细胞SPRY4-ITI表达量(0.32±0.03)与对照组(1.00)比较明显降低(P<0.01)。

2.3 干扰SPRY4-IT1表达对髓母细胞瘤Daoy细胞增殖能力的影响

CCK-8实验表明，与对照组相比，si-SPRY4-IT1组髓母细胞瘤Daoy细胞增殖活力明显下降(图2a)。24 h时si-SPRY4-IT1组细胞增殖活力开始低于对照组，96 h si-SPRY4-IT1组(OD值1.477±0.144)与对照组(OD值2.209±0.137)差异最为明显(P<0.05)。通过克隆形成实验进一步检验了干扰SPRY4-1TI的表达后髓母细胞瘤Doay细胞的克隆形成能力受到抑制。si-SPRY4-IT1组细胞的克隆形成率为(36.33±3.79)%，对照组细胞的克隆形成率为(52.00±3.00)%，si-SPRY4-ITl组细胞克隆形成率显著低于对照组细胞(P<0.05，图2b)，表明干扰SPRY4-ITl的表达后细胞增殖能力明显受到抑制，与CCK-8实验结果一致。

2.4 干扰SPRY4-IT1表达对髓母细胞瘤Daoy细胞侵袭迁移能力的影响

细胞体外侵袭实验结果显示，Daoy细胞株侵袭能力明显受到抑制,抑制率33.95%，差异有统计学意义(P<0.01)。细胞体外迁移实验显示si-SPRY4-IT1组较对照组细胞迁移能力明显受到抑制，抑制率42.49%，差异有统计学意义(P<0.01，表2)。

2.5 干扰SPRY4-IT1表达对髓母细胞瘤Daoy细胞基质金属蛋白酶(MMP)的影响

以GAPDH蛋白为内参，Western blot实验检测干扰SPRY4-IT1的表达对髓母细胞瘤Daoy细胞基质金属蛋白酶的影响(图3)，结果显示，si-SPRY4-IT1组(0.40±0.05)MMP-2表达量较对照组(1.00)明显降低(P<0.05)，而MMP-9未见明显变化。

GroupInvasion(cells/well)Metastasis(cells/well)Inhibition(%)Control215±7273±1233.95si-SPRY4-IT1142±8**161±12**42.49

**P<0.01vscontrol group

Fig. 3 Effect of interference SPRY4-IT1 expression on MMP-2 and MMP-9 of medulloblastoma cell line Daoy 1： Control group； 2： si-SPRY4-IT1 group

3 讨论

随着大规模高通量芯片和二代测序技术的发展，人们发现在基因组中具有编码能力的基因不足2%，大多数基因序列转录为非编码RNA[7]，其中就包括长链非编码RNA。与短链非编码RNA相比，长链非编码RNA的认识则经历了漫长的过程，最初认为长链非编码RNA只是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶2转录的副产物，不具有生物学功能[8,9]。随着研究的不断深入，越来越多的证据表明长链非编码RNA在多种生物学过程中扮演着重要角色，例如，HOXC基因座能转录一种LncRNA HOTAIR，后者可募集染色质重构蛋白复合物PRC2并诱导HOXD基因座产生抑制性的染色体结构，使HOXD基因座在长达40 kb的范围内抑制转录的发生[10]，在肾透明细胞癌中干扰SPRY4-IT1的表达能抑制肿瘤细胞增殖、迁移及上皮间质转化(EMT)[11]。

SPRY4-IT1最初是在动物脂肪组织中发现的长度为706 bp的具有二级发夹结构的转录本，在人胎盘、膀胱、大脑、肾脏、肝脏、肌肉、前列腺、胸腺等多种组织中都有不同程度的表达[12，13]。Joseph Mazar等通过PCR技术发现SPRY4-IT1转录本起始于SPRY4基因第一个内含子并延续到其第三个外显子，其前体在从细胞核进入细胞质的过程中剪切掉一个长约244 nt的核苷酸序列后才成为成熟的SPRY4-IT1，在黑色素瘤中作用于lipin家族中的lipin 2引起肉毒酰胆碱及三酰甘油等明显增加，而作为红细胞膜外层脂类主要成分之一的磷脂酰胆碱显著降低，最终导致细胞脂毒性[14，15]。在胶质瘤中，干扰SPRY4-IT1能够抑制胶质瘤细胞的生长、迁移及EMT[6]。在胃癌组织中SPRY4-IT1表达明显高于癌周组织，且与瘤体的发生发展密切相关，体外实验表明下调SPRY4-IT1使胃癌细胞的侵袭迁移及增殖能力均受到抑制，并且证明SPRY4-IT1通过cyclin D1、MMP2、MMP9分别影响细胞的增殖及迁移能力[16]。以往的研究表明SPRY4-IT1扮演者“癌基因”的角色，然而，Min Xie及其同事却发现SPRY4-IT1在胃癌组织中表达下降，胃癌组织中SPRY4-IT1高表达患者中位生存时间较低表达者长，其体外实验表明SPRY4-IT1抑制胃癌细胞生长[17]。SPRY4-IT1在髓母细胞瘤中的生物学功能仍不清楚。

本研究通过特异性siRNA干扰 SPRY4-IT1在髓母细胞瘤Daoy细胞株中的表达，研究结果显示干扰SPRY4-IT1的表达可显著抑制髓母细胞瘤Daoy细胞的增殖、侵袭和迁移能力，进一步实验表明干扰SPRY4-IT1的表达能通过MMP-2影响细胞的侵袭迁移能力。SPRY4-IT1在影响髓母细胞瘤Daoy细胞增殖、凋亡及细胞信号通路(如EMT信号通路)方面的深层次机制仍不清楚，SPRY4-ITl对髓母细胞瘤Daoy细胞生物学行为影响的分子机制仍需进一步研究。

综上所述，本研究确定了SPRY4-IT1对髓母细胞瘤Daoy细胞侵袭、迁移及增殖的促进作用，并通过MMP-2影响髓母细胞瘤Daoy细胞的侵袭迁移能力，为髓母细胞瘤的诊断和治疗提供了新的候选分子，也为进一步研究长链非编码RNA对髓母细胞瘤细胞生物学功能的影响奠定了基础。

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Effect of long noncoding RNA SPRY4-IT1 on proliferation and metastasis of medulloblastoma

SHI Peng-fei1, JI Hai-long2, LUO Yong-kang2, MAO Tian-ming2, CHEN Xi3, ZHOU Kai-yu1△

(1. the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000; 2. Department of Neurosurgery, 3. Department of Pathology, Zhejiang Taizhou Municipal Hospital, Taizhou 318000, China)

Objective: To investigate the effects of long non-coding RNA SPRY4-IT1 (LncRNA) on proliferation and metastasis of medulloblastoma cells. Methods: SPRY4-IT1siRNA and control fluorescence siRNA were transfected into medulloblastoma cell line Daoy with Lipofectamine 2000 and were divided into control group and si-SPRY4-IT1 group. Relative expression of SPRY4-IT1 mRNA were detected by real-time quantitative PCR. The change of cell proliferation were examined using CCK-8 kit and clone forming experiment.The change of cell invasion and metastasis were examined by matrigel invasion assay and cell metastasis experiment respectively, The expression of matrix metalloproteinase MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blot. Results: In si-SPRY4-IT1 group,the SPRY4-IT1 mRNA expression level, cell proliferation in vitro,cell invasion and migration ability, MMP-2 protein expression were significantly lower than those in the control group. Conclusion: Interference SPRY4-IT1 expression has prominent inhibitory effect on the cell proliferation、invasion and metastasis of medulloblastoma cell line Daoy.

medulloblastoma; long noncoding RNA(LncRNA); SPRY4-IT1； proliferation； invasion and metastasis

浙江省中医药管理局科技计划资助项目(2013ZA133,2015ZB133)；台州市科技局科技计划资助项目(14SF05)

2016-03-28 【修回日期】2016-10-24

R364.3

A

1000-6834(2017)01-078-05

△【通讯作者】Tel： 13957680507； E-mail： kerry2000year@163.com