不同温度刺激与大气PM2.5对大鼠肺泡巨噬细胞的交互毒性作用研究*

罗 斌， 刘江涛， 费高强， 韩 婷， 王丽娜， 晚亚雄， 张 凯， 王任洪

(兰州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生研究所， 甘肃兰州 730000)

不同温度刺激与大气PM2.5对大鼠肺泡巨噬细胞的交互毒性作用研究*

罗 斌△， 刘江涛+， 费高强+， 韩 婷， 王丽娜， 晚亚雄， 张 凯， 王任洪

(兰州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生研究所， 甘肃兰州 730000)

目的：探究不同温度刺激与大气PM2.5对大鼠肺泡巨噬细胞的交互毒性作用。方法：提取大鼠肺泡巨噬细胞，分别在18℃、24℃、30℃、37℃、43℃下培养，每个温度组下设置不同浓度PM2.5处理，依次为100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml、0 μg/ml。处理8 h后，观察两因素对大鼠肺泡巨噬细胞组织形态学、细胞存活率和吞噬功能的影响。结果：同一温度下,不同剂量PM2.5组的相对细胞存活率和吞噬功能均显著低于空白对照组(P<0.05)，且剂量越高，毒性作用越强,吞噬功能越弱。而在各温度组间，37℃组相对细胞存活率和吞噬功能最高，而随着温度的升高或降低，相对细胞存活率降低，吞噬功能下降。结论：不同温度刺激和大气PM2.5处理均会对大鼠肺泡巨噬细胞产生毒性作用，使其吞噬能力降低，并且温度与37℃差距越大、PM2.5浓度越高时毒性作用越明显。

不同温度刺激；大气PM2.5；肺泡巨噬细胞；交互毒性作用

【DOI】 10.12407/j.cjap.5347.2017.018

PM2.5是指空气动力学直径小于2.5 μm的可吸入颗粒物，它能通过呼吸道被人体吸入，到达肺部，部分颗粒物可通过气体交换进入血液并到达各远隔器官，引起一系列炎症反应，而这也是大气PM2.5对人体的主要毒性作用[1]。研究认为大气颗粒物尤其是PM2.5能诱发和加重呼吸系统疾病，引起患者死亡率和发病率增加。其机制可能与PM2.5对肺泡巨噬细胞的毒性有关。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages, AMS)作为肺部的“清道夫”，具有吞噬、分泌和免疫的作用，作为一道屏障保护着人体[2]。有大量文献报道，大气颗粒物PM2.5进入肺部会对肺泡巨噬细胞产生毒性作用，使肺泡巨噬细胞分泌炎症因子，并影响其吞噬功能[3]。这些由肺泡巨噬细胞在接触到颗粒物时所释放的炎症物质能激活肺中其它细胞，如控制和促进白细胞在肺及气道内募集并引起炎性反应。此外，颗粒物还能降低AMs吞噬细菌能力的氧化自由基介导过程，从而抑制AMs对感染物质的反应[4-6]。因此，呼吸道疾病患者暴露颗粒物后会促进已有炎症反应和抑制抗感染免疫功能，从而加重已有呼吸道疾病。此外，呼吸系统疾病的发生和加重还与天气的变化有密切的关系，气温过高或过低都会对其产生严重影响。在实际环境中，不同温度与PM2.5往往同时存在并影响着人体的健康，并有研究认为二者之间存在着交互作用[7, 8]。本团队的前期动物实验也发现低温刺激可能增加大气PM2.5对大鼠肺组织及系统炎症的影响[9]。体外实验方面，H.SALMAN等在体外培养腹腔巨噬细胞，选择24℃和乳胶颗粒处理细胞，发现与37℃对照组相比，24℃组腹腔巨噬细胞的的吞噬能力下降[10]。

本研究通过体外培养巨噬细胞，使用不同浓度PM2.5在不同温度培养下对其进行处理，检测处理之后肺泡巨噬细胞组织形态学、细胞存活率和吞噬功能，探究不同温度刺激与大气PM2.5对肺泡巨噬细胞的交互毒性作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

1.1.1 主要试剂 胎牛血清(PAN，德国)；RPMI1640培养基(Hyclone，美国)；四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，MTT)；中性红染液(Solarbio，中国)。

1.1.2 主要仪器 CO2培养箱(THERMO，美国)；倒置显微镜(Olympus,日本)；酶标仪(Biotek,美国)。

1.2 PM2.5采集

于兰州大学某实验楼顶空旷地带(离地10 m)，利用PM2.5采样器(TH-150CⅢ型智能中流量悬浮微粒物采样器，武汉，天虹智能仪表厂)在2015年4月到8月连续采样，流量100 L/min，采集于玻璃纤维滤膜。处理时将滤膜剪为1 cm×1 cm的小块，收集于干净的小烧杯内，使用双蒸水将其完全浸没，利用超声波清洗仪振荡洗脱颗粒物，震荡3次，每次30 min。6层纱布过滤，收集滤液于离心管中，8 000 r/min离心15 min，收集下层沉淀物于培养皿内，真空冷冻干燥，颗粒物称重后避光保存，待用。染毒前，使用RPMI1640培养基将PM2.5配制成浓度为500 μg/ml的母液，超声振荡15 min，高温高压灭菌15 min，置于4℃冰箱待用。

1.3 实验动物及分组

SPF级健康雄性大鼠35只，10周龄，购买于甘肃省中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(甘)2004-0006。体重275.34±20.55 g。实验前利用Excel工作表按体重将实验动物随机分为5组(n=7)。

1.4 实验方法

1.4.1 肺泡巨噬细胞的提取 实验前大鼠禁食禁水8 h，腹腔注射7%的水合氯醛麻醉大鼠，置于鼠台，将冰块堆积于大鼠周围，开腹并行腹主动脉放血；暴露气管，插入灌胃针并结扎、固定，使用10 ml注射器灌注无菌冷PBS溶液8 ml，轻轻按摩肺脏30 s后回收灌洗液，重复5次。将收集到的灌洗液装入50 ml离心管中，1 200 r/min，离心15 min，一次性弃上清。使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，并使用微量加样枪吹打混匀2 min，使用细胞计数板计数并调整细胞浓度为2×105cells/ml，接种于96孔板中，每孔100 μl。置于37℃、5% CO2培养箱中培养3 h，使用灭菌PBS洗去未贴壁细胞。

1.4.2 PM2.5处理 本实验共设置5个温度组，分别为18℃、24℃、30℃、37℃、43℃。每个温度组设置4个PM2.5处理组，依次为高剂量(100 μg/ml)组、中剂量(50 μg/ml)组、低剂量(25 μg/ml)组、空白对照组。在96孔板每孔加入100 μl对应浓度的PM2.5溶液，在相应温度、5% CO2的环境下培养8 h，每组设置6个复孔。

1.5 细胞毒性检测

采用MTT分析法。实验终止前4 h每孔加入MTT溶液20 μl。4 h后，小心弃上清，每孔加入100 μl DMSO溶液。放置15 min，在酶标仪上570 nm测定光密度(OD)值,并与37℃ 0 μg /ml组的OD值做比，得出相对细胞存活率[11,12]。

1.6 吞噬功能检测

采用中性红法。在相应实验条件下培养后除去培养板的上清液，PBS 洗 1 遍后，加入 200 μl含0.1%中性红溶液(为防止中性红结晶的形成，中性红溶液在 37℃培养箱过夜，用前过滤器过滤)。孵育 30 min后，吸弃中性红溶液。PBS 洗 3 次，每次吸净孔内残留液体。每孔加入无水乙醇和乙酸 1∶1 体积混合液 200 μl，裂解 10 min，充分混匀。酶标仪测定550 nm处OD值[13]。

1.7 数据处理

2 结果

2.1 不同温度与不同浓度PM2.5处理对肺泡巨噬细胞形态影响

实验8 h后，在倒置显微镜下观察大鼠肺泡巨噬细胞，可见细胞形状不规则，在细胞胞浆中可见被吞噬的颗粒物，部分细胞已经裂解死亡，有细胞碎片出现。其中图1为50 μg/ml PM2.5处理的不同温度下大鼠肺泡巨噬细胞的形态，提示不同温度对细胞的损伤不同；图2则为37℃下不同浓度PM2.5处理对于大鼠肺泡巨噬细胞的影响，可见PM2.5浓度不同，细胞的存活状况也不同(图1、图2)。

Fig. 1 Photomicrograph of rat alveolar macrophages(AMs)after incubation for 8 h with the ambient PM2.5 in vitro under different temperatures( ×40) A: 18℃； B: 24℃； C: 30℃； D: 37℃； E: 43℃

Fig. 2 Photomicrograph of rat alveolar macrophages(AMs)after incubation for 8 h with the ambient PM2.5 in vitro under different dose( ×40) A: 100 μg/ml； B: 50 μg/ml； C: 25 μg/ml； D: 0 μg/ml

2.2 不同温度与不同浓度PM2.5处理对巨噬细胞的毒性作用(MTT法)

不同温度与不同浓度PM2.5处理对大鼠肺泡巨噬细胞的毒性作用见表1。在不同温度条件下，高剂量组、中剂量组、低剂量组的平均OD值均显著低于空白对照组(P<0.05)，其相对细胞存活率也低于空白对照组；并在18℃组中，各PM2.5处理组的平均OD值均显著低于37℃组(P<0.05)；在同一温度下，随着PM2.5处理浓度的增大，各组的平均OD值逐渐降低，相对细胞存活率逐渐下降；在相同PM2.5处理剂量下，37℃各组的平均OD值最高，相对细胞存活率最高，而随着温度的变化，不同温度各组的平均OD值逐渐降低，相对细胞存活率降低。不同温度与不同浓度PM2.5处理各组的实验结果进行的析因分析并未发现具有显著的交互作用,但实验数据显示，温度相对于37℃越低、PM2.5浓度越大，对巨噬细胞造成的毒性作用越强，相对细胞存活率越低(P<0.05)。

2.3 不同温度与不同浓度PM2.5处理对巨噬细胞吞噬功能的影响

检测巨噬细胞吞噬功能的结果见表2。结果显示，18℃、24℃、30℃、43℃组的吞噬功能均显著低于37℃组(P<0.05)，且温度与37℃差距越大，其吞噬功能下降越明显(P<0.05)； 不同浓度PM2.5组间比较显示，各PM2.5剂量组的吞噬功能均显著低于空白对照组(P<0.05)，且剂量越高，吞噬功能越差(P<0.05)；交互作用分析未发现不同温度刺激与PM2.5之间存在有交互作用，但数据显示温度与37℃差距越大、PM2.5浓度越大，巨噬细胞的吞噬功能越差(P<0.05)。

3 讨论

流行病学研究认为，不同温度刺激和大气颗粒物均会增加呼吸系统疾病的发病率和死亡率，并且二者共同作用时的有害效应更加显著。已有体内实验表明，低温刺激和大气PM2.5染毒对大鼠肺部和系统炎性因子的影响可能存在交互作用[9]。本研究选用大鼠肺泡巨噬细胞作为研究对象，给予其不同温度刺激和不同浓度PM2.5处理。结果表明，PM2.5浓度越大，对大鼠肺泡巨噬细胞的毒性作用越大，相对细胞存活率越小，吞噬功能越弱。在不同温度组间，37℃组巨噬细胞的毒性作用最小，吞噬功能最大，随着温度升高或降低，毒性作用增大，相对细胞存活率下降，吞噬功能降低。但对这两因素进行交互作用分析后，并没有发现不同温度刺激和PM2.5处理对于大鼠肺泡巨噬细胞的显著交互毒性作用，但其结果可提示温度与37℃差距越大、PM2.5浓度越大，巨噬细胞的吞噬功能越差，对其毒性作用越强。

Tab. 1 Cytotoxicity different temperatures and ambient PM2.5 on rat alveolar macrophages

*P<0.05vs0 μg/ml;##P<0.05vs37℃ group

Tab. 2 Phagocytic activity of rat alveolar macrophages loaded with different temperature and ambient PM2.5

*P<0.05vs0 μg/ml；##P<0.05vs37℃ group

研究发现直径小于2.5 μm的大气颗粒物可以进入肺部到达肺泡，一部分被吸收入血，一部分会被肺泡巨噬细胞吞噬[14]。本实验中，PM2.5处理大鼠肺泡巨噬细胞8 h后，由于大鼠肺泡巨噬细胞吞噬了PM2.5颗粒，颗粒物在细胞内占据了一部分空间，巨噬细胞吞噬其他颗粒物的能力下降。同时PM2.5的组成和浓度会影响其对大鼠肺泡巨噬细胞的毒性，其引起细胞凋亡和炎性反应的能力也不同[2,15,16]。在本实验中，选择了4个PM2.5剂量组进行染毒，结果具有明显的剂量-反应关系。大气PM2.5中含有的不同成分会对巨噬细胞造成毒性作用，其浓度越大，这种作用越明显。与此同时，不同温度也会对细胞造成损伤：一方面，不同温度刺激会对细胞造成直接损伤；另一方面，会使细胞分泌系统炎症因子，降低细胞功能[17]。本实验中，温度低于或高于37℃，细胞存活率和吞噬功能降低，这正反映了这样的损伤作用。实验结果也提示温度越低或越高及PM2.5浓度越高，吞噬能力越低，其毒性作用越明显。此外，在同剂量的PM2.5染毒下，温度与37℃差距越大时肺泡巨噬细胞的吞噬能力越低，由此可见低温或者高温都能降低巨噬细胞的吞噬能力，从而增加PM2.5的呼吸系统毒性作用，从而引起或加重呼吸系统疾病。

本实验通过体外实验来研究不同温度刺激和PM2.5处理对于大鼠肺泡巨噬细胞的影响，为了更进一步的探讨两者对巨噬细胞作用的机制，仍需要进一步分析不同温度刺激和PM2.5染毒对巨噬细胞的氧化应激及炎症反应的影响；此外，大气颗粒物的不同成分的毒性作用存在着差异，未来还要通过研究不同的成分对于巨噬细胞的毒性作用的差异。

综上所述，不同温度刺激和大气PM2.5处理均会对大鼠肺泡巨噬细胞产生毒性作用，并使其吞噬能力降低，温度与37℃差距越大、PM2.5浓度越大时毒性作用越强，并有一定的交互作用。

[1] 杨新兴, 冯丽华, 尉 鹏. 大气颗粒物PM2.5及其危害[J]. 前沿科学, 2012, 6(1): 22-31.

[2] Hogg JC, van Eeden S. Pulmonary and systemic response to atmospheric pollution[J].Respirol, 2009, 14(3): 336-346.

[3] Hiraiwa K, van Eeden SF. Contribution of lung macrophages to the inflammatory responses induced by exposure to air pollutants[J].MediatorsInflamm， 2013: 619-523.

[4] Amakawa K, Terashima T, Matsuzaki T,etal. Suppressive effects of diesel exhaust particles on cytokine release from human and murine alveolar macrophages[J].ExpLungRes, 2003, 29(3): 149-164.

[5] Mundandhara SD, Becker S, Madden MC. Effects of diesel exhaust particles on human alveolar acrophage ability to secrete inflammatory mediators in response to lipopolysaccharide[J].ToxicolInVitro, 2006, 20(5): 614-624.

[6] Yang HM, Barger MW, Castranova V,etal. Effects of diesel exhaust particles (DEP), carbon black, and silica on macrophage responses to lipopolysaccharide: evidence of DEP suppression of macrophage activity[J].JToxicolEnvironHealthA, 1999, 58(5): 261-278.

[7] Carder M, McNamee R, Beverland I,etal. Interacting effects of particulate pollution and cold temperature on cardiorespiratory mortality in Scotland[J].OccupEnvironMed, 2008, 65(3): 197-204.

[8] Ren C, Tong S. Temperature modifies the health effects of particulate matter in Brisbane, Australia[J].IntJBiometeorol, 2006, 51(2): 87-96.

[9] 罗 斌, 王丽娜, 晚亚雄, 等. 低温条件下大气PM2.5对大鼠心脏抗氧化能力及炎症反应的影响[J]. 中国应用生理学杂志， 2015, 31(1): 11-13.

[10]Salman H, Bergman M, Bessler H,etal. Hypothermia affects the phagocytic activity of rat peritoneal macrophages[J].ActaPhysiolScand, 2000, 168(3): 431-436.

[11]孟紫强, 张全喜, 耿 红. 沙尘暴细颗粒物致大鼠肺泡巨噬细胞DNA损伤[J]. 环境与职业医学, 2006, (03): 185-188.

[12]何云凌, 吴丽颖, 黄 欣, 等. 自噬对不同低氧条件下PC12细胞存活的影响[J]. 中国应用生理学杂志， 2013, 29(3): 193-196.

[13]谭 庆, 罗炳德, 张 培, 等. 青蒿琥酯对高温内毒素复合因素下巨噬细胞吞噬功能的影响[J]. 中国工业医学杂志, 2005, 18(2): 98-100.

[14]陶 燕, 刘亚梦, 米生权, 等. 大气细颗粒物的污染特征及对人体健康的影响[J]. 环境科学学报, 2014, (03): 592-597.

[15]Huang YC, Li Z, Harder SD,etal. Apoptotic and inflammatory effects induced by different particles in human alveolar macrophages[J].InhalToxicol, 2004, 16(14): 863-878.

[16]Mukae H, Hogg JC, English D,etal. Phagocytosis of particulate air pollutants by human alveolar macrophages stimulates the bone marrow[J].AmJPhysiolLungCellMolPhysiol, 2000, 279(5): L924-931.

[17]Mourtzoukou EG, Falagas ME. Exposure to cold and respiratory tract infections[J].IntJTubercLungDis, 2007, 11(9): 938-943.

Impact of different temperatures and ambient PM2.5 on the cytotoxicity and cytophagocytic function of alveolar macrophages of rat

LUO Bin△, LIU Jiang-tao+, FEI Gao-qiang+, HAN Ting, WANG Li-na, WAN Ya-xiong, ZHANG Kai, WANG Ren-hong

(Institute of Occupational Health and Environmental Health, School of Public Health,Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Objective: To investigate the interactive effects of different temperatures and ambient PM2.5 on the rat alveolar macrophages. Methods: The rat alveolar macrophages were collected. The cells were exposed in vitro to 18℃, 24℃, 30℃, 37℃ and 43℃ with PM2.5 at the concentrations of 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml and 0 μg/ml respectively. The cells were cultured in the different cases for 8 hours, then cytotoxicity was assessed by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)reduction assay and phagocytosis function of macrophages was assessed by neutral red absorption test. Results: The relative survival rate and the cytophagocytic function of alveolar macrophages of rats among the different concentration groups decreased significantly (P<0.05) compared with the blank control group. Both were dose-dependent. The 37℃ group had the highest level of relative survival rate and the cytophagocytic function compared with other different temperatures groups. Interactive effect of different temperatures and ambient PM2.5 was not observed. But the lower temperature and the higher PM2.5 concentration group had stronger toxicity to alveolar macrophages. Conclusion: The results suggested that different temperatures and ambient PM2.5 have cytotoxicity on alveolar macrophages，injuring the phagocytosis. The two factors had some interaction.

different temperatures; ambient PM2.5; cytotoxicity; cytophagocytic; macrophages

国家自然科学基金资助项目(41405108)；兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金项目(lzujbky-2015-181)；兰州大学“本科教学工程”国家级大学生创新创业训练计划(201510730159)

2016-03-14 【修回日期】2016-10-26

R122

A

1000-6834(2017)01-071-05

△【通讯作者】Tel: 13919783313; E-mail: luob@lzu.edu.cn;+： 共同第一作者