籽鹅不同等级卵泡生殖相关激素受体基因的表达*

计 红, 马 莉, 张伟宏, 李 悦， 连 帅， 郭文晋， 袁建斌, 郭景茹, 刘艳芝, 甄 莉, 杨焕民

(黑龙江八一农垦大学, 大庆 163319)

籽鹅不同等级卵泡生殖相关激素受体基因的表达*

计 红, 马 莉, 张伟宏, 李 悦， 连 帅， 郭文晋， 袁建斌, 郭景茹, 刘艳芝, 甄 莉, 杨焕民△

(黑龙江八一农垦大学, 大庆 163319)

目的：检测籽鹅不同等级卵泡不同生殖相关激素受体mRNA的表达。方法：选用1只8月龄产蛋期籽鹅，处死后分离各级别卵泡(F1、F2、F3、F4、F5、SYF、LWF)，采用实时荧光定量PCR方法检测促卵泡激素受体(FSHR)、促黄体生成素受体(LHR)、雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)、生长激素受体(GHR)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)6种生殖相关激素受体mRNA的表达量变化。结果：SYF和LWF中LHR、GHR和IFGBP-1 mRNA表达量较低，而F1-F5级卵泡中表达量较高；SYF和LWF中ERβ mRNA表达量较高，而等级卵泡中表达量较低。结论：本实验研究了不同等级卵泡FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR和IGFBP-1 mRNA的变化规律，为研究禽类产蛋机制提供基础数据。

籽鹅；卵泡；激素受体；表达量

Zi-goose; follicle; hormone receptor; expression

【DOI】 10.12047/j.cjap.5328.2017.014

禽类卵泡的最大特点是很快地从未成熟卵泡变为成熟卵泡，并且呈现明显的等级。性成熟开始后，禽类卵巢重量不断地增加。性成熟后，卵巢体积非常大，卵巢上存在大量发育中的卵泡。卵巢皮质含有5～6个体积依次增大的成熟卵泡和一些小卵泡。成熟母鸡的卵巢通常包含4～6个按等级顺序排列体积依次变小的黄色的排卵期前卵泡(F1、F2、F3、F4、F5、F6)，很多等级前卵泡(小黄卵泡，大白卵泡和小白卵泡)和几个排卵后卵泡。这些小卵泡还没有进入卵泡等级库，根据尺寸对其进行划分，直径小于1 mm的称为小白卵泡(small white follicle，SWF)，直径在2～4 mm称为大白卵泡(large white follicle，LWF)，直径在5～10 mm的称为小黄卵泡(small yellow follicle，SYF)[1]。

卵泡的发育受到多种因素的影响，尤其是下丘脑-腺垂体-性腺轴激素如促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)和促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)等。这些激素若要发挥调控卵泡发育的作用，就必须与卵泡相关的激素受体结合，进而引发相关调控反应。籽鹅是东北地区的优良地方品种，也是世界上产蛋量最高的鹅品种之一。因此本研究采集产蛋期籽鹅不同等级卵泡，通过实时荧光定量PCR检测籽鹅不同等级卵泡生殖相关激素受体促卵泡激素受体(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)、促黄体生成素受体(luteinizing hormone receptor，LHR)、雌激素受体α(estrogen receptor alpha，ERα)、雌激素受体β(estrogen receptor beta，ERβ)、生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1) mRNA的表达量，为研究禽类生殖生理提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用一只8月龄产蛋期籽鹅，体重4 kg，处死后分离各级别卵泡(F1、F2、F3、F4、F5、SYF、LWF)，将卵黄冲洗干净，保留卵泡壁，置于液氮中待用。

1.2 目的基因片段扩增

Trizol法提取各样品总RNA，电泳和核酸定量仪检测RNA质量。提取的RNA达到实验要求后，将其反转为cDNA。参考NCBI上注册发表的原鸡、绿头鸭等多种禽类GAPDH(内参)、FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR和IGFBP-1核苷酸序列，设计相应基因的引物。引物均由上海生工合成(表1)。将反转录cDNA作为模板，分别扩增获得目的基因片段。将PCR产物进行胶回收、连接、转化及测序鉴定。

Tab. 1 Parameters of primer pairs for the target genes and the PCR products

GenePrimer(5'-3')Productsize/(bp)GAPDHF:GCTGATGCTCCCATGTTCGTGATR:GTGGTGCAAGAGGCATTGCTGAC86FSHRF:TCCTGTGCTAACCCTTTCCTCTAR:AACCAGTGAATAAATAGTCCCATC207LHRF:GTAACACTGGAATAAGGGAATR:GAAGGCTTGACTGTGGATA191ERαF:ACCCAAACAGACCATTCAACGAAR:CGCCAGACTAAGCCAATCATCAG187ERβF:AAGTGGGAATGATGAAATGTGGCR:GGACTGACCGTGCTGAGGAGAAT163GHRF:GCCCCTGCTGACATTTGAGAATR:GGCCACTGCAGAAGATCATCAC115IGFBP-1F:CCTTGTCAGAAGGAGCTCTAR:CATCCAGTGAAGTTTCACACT145

GAPDH： Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase； FSHR： Follicle stimulating hormone receptor； LHR： Luteinizing hormone receptor； ERα： Estrogen receptor alpha； ERβ： Estrogen receptor beta； GHR： Growth hormone receptor； IGFBP-1： Insulin-like growth factor binding protein-1

1.3 基因表达量检测

提取各样品总RNA，反转录为cDNA。将前期实验保存的GAPDH和各基因质粒进行梯度稀释，采用双标准曲线对各基因进行定量检测。

荧光定量PCR反应条件分别为：FSHR、ERα、ERβ、IGFBP-1、GHR基因：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。LHR基因：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，52℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。

荧光定量PCR扩增体系：模板cDNA 0.5 μl，P1 (10 μmol/L) 0.5 μl，P2 (10 μmol/L) 0.5 μl，SYBRPremix Ex TaqTM(2×)，12.5 μl，ddH2O 11.0 μl，总体积 25.0 μl。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件处理数据，采用ANOVA对数据进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增目的片段

分别用所设计的引物扩增出FSHR(207 bp)、LHR(191 bp)、ERα(187 bp)、ERβ(163 bp)、GHR(115 bp)及IGFBP-1(145 bp)的基因产物，经凝胶电泳的结果如图1。

Fig. 1 PCR products of gene

M： DL2000； A： FSHR; B： LHR; C： ERα; D： ERβ; E： GHR; F： IGFBP-1

将FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR与IGFBP-1基因扩增片段的测序结果与NCBI数据库上其他物种相应基因进行比对。籽鹅与绿头鸭基因同源性比对结果如下： FSHR为99%；LHR为99%；ERα为99%；ERβ为98%；GHR为99%；IGFBP-1为 97%。比对结果显示上述基因都有很高的同源性，确定所扩增片段为目的基因，可进行下一步实验。

2.2 生殖相关激素受体表达量

经过荧光定量PCR检测，不同等级卵泡生殖相关激素受体FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR与IGFBP-1 mRNA表达量结果如表2。

与F1级相比， F2、F3、F5级卵泡FSHR mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。与F2级相比，其他各级卵泡FSHR mRNA表达量差异显著(P<0.01)。与F3级相比，F5级卵泡FSHR mRNA表达量差异不显著，其他级别卵泡FSHR mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。F4与F1、SYF、LWF中FSHR mRNA表达量差异不显著，与其他各组之间差异极显著(P<0.01)。F5与除F3级卵泡以外的其他各级卵泡FSHR mRNA表达量均差异极显著(P<0.01)。SYF与F1、F4、LWF级卵泡FSHR mRNA表达量异不显著。

SYF和LWF中LHR mRNA表达量最低，F5级卵泡LHR mRNA表达量最高。F1与F2级卵泡LHR mRNA表达量差异不显著，其他不同等级卵泡LHR mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。

F1到F3级卵泡ERα mRNA表达量逐渐升高，而后波动降低至LWF。F3级卵泡ERα mRNA表达量最高，F1级卵泡表达量最低。不同等级卵泡ERα mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。

F1与F3、F4级卵泡ERβ mRNA表达量差异不显著，与其他各组差异极显著(P<0.01)。F2与除F5级卵泡以外的其他各组ERβ mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。F3与F1、F4级卵泡ERβ mRNA表达量差异不显著，与F5差异显著(P<0.05)，与其他各组差异极显著(P<0.01)。F4与F5 ERβ mRNA表达量差异显著(P<0.05)，与F2、SYF及LWF差异极显著(P<0.01)。F5与与SYF及LWF ERβ mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。SYF、LWF与其他各组ERβ mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。

F1与SYF级卵泡GHR mRNA表达量差异显著(P<0.05)，与其他各组差异极显著(P<0.01)。F2与其他各级卵泡GHR mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。F3与除F5级卵泡以外的其他各组GHR mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。F4与其他各级卵泡GHR mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。F5与除F3级卵泡以外的其他各组GHR mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。SYF与LWF中GHR mRNA表达量差异不显著，与F1级卵泡差异显著(P<0.05)，与其他各组差异极显著(P<0.01)。

F1与F2、SYF和LWF中IGFBP-1 mRNA表达量差异不显著，与其他各级卵泡差异极显著(P<0.01)。F2与F1、SYF和LWF中IGFBP-1 mRNA表达量差异不显著，与其他各级卵泡差异极显著(P<0.01)。F3、F4、F5与其他各级卵泡IGFBP-1 mRNA表达量差异极显著(P<0.01)。SYF与F1、F2和LWF中IGFBP-1 mRNA表达量差异不显著，与其他各级卵泡差异极显著(P<0.01)。

FSHRLHRERαERβGHRIGFBP-1F11.00±0.251.00±0.011.00±0.041.00±0.011.00±0.161.00±0.00F21.58±0.06**1.07±0.02**5.19±0.05**2.65±0.08**3.23±0.25**1.24±0.07F32.11±0.19**##0.71±0.19**10.08±1.15##1.09±0.03##1.92±0.12**##20.84±1.79**##F40.92±0.12##△△1.76±0.10**7.37±0.65△△0.98±0.07##1.59±0.10**##△△6.87±1.49**##F52.09±0.27**##▲▲3.06±0.05**6.38±0.10▲▲2.00±0.50*△▲1.99±0.07**##▲▲4.88±0.64**##SYF1.23±0.10##△△○○0.22±0.09**6.43±0.11○○7.20±0.40**##△△○○0.74±0.11*##△△▲▲○○0.23±0.12△△▲▲○○LWF0.82±0.13##△△○○0.04±0.02**1.95±0.05○○14.75±0.77**##△△○○0.56±0.16*##△△▲▲○○0.36±0.13△△▲▲○○

FSHR： Follicle stimulating hormone receptor； LHR： Luteinizing hormone receptor； ERα： Estrogen receptor alpha； ERβ： Estrogen receptor beta； GHR： Growth hormone receptor； IGFBP-1： Insulin-like growth factor binding protein-1； SYF： Small yellow follicle； LWF： Large white follicle

*P<0.05，**P<0.01vsF1 group;###P<0.01vsF2 group;#△P<0.05，△△P<0.01vsF3 group;#▲P<0.05，▲▲P<0.01vsF4 group;#○○P<0.01vsF5 group

3 讨论

FSH和LH是下丘脑-腺垂体-性腺轴上不可或缺的一部分，它们参与调控类固醇激素的合成和配子产生。雌性哺乳动物卵泡内膜细胞在LH作用下产生的雄烯二酮和睾酮，通过扩散进入颗粒细胞，颗粒细胞在FSH作用下使芳香化酶活性增强，进而使雄烯二酮转变为雌酮，睾酮转变为雌二醇[2]，进而调控生殖系统。张静等研究也表明，FSH具有较强的上调窦前期的颗粒细胞端粒酶活性的作用[3]。腺垂体分泌FSH和LH后，二者可结合相应受体完成信息传递功能。

周等研究表明绍鸭各级卵泡(F1、F3、F5和LWF)颗粒层FSHR表达量之间差异不显著。Liu等对鸡卵巢卵泡进行研究，发现LWF、SYF到F5级卵泡FSHR表达量逐渐升高，F5级最高；然后逐渐下降到F1级卵泡[2]，提示FSHR的在不同等级卵泡的表达差异可能与促性腺激素对禽类卵泡的调节尤其是等级卵泡的选择有重要关系。上述结果提示，禽类FSH与较小排卵前卵泡SYF和FSHR结合，主要是促进小卵泡迅速生长发育，细胞快速增殖；与大卵泡结合，可能是与其他激素协同作用，抑制未成熟卵泡的排卵，因此F1级卵泡FSHR表达量最低，以减少对FSH的反应性，从而促进排卵的发生。

LH是禽类卵泡发育和排卵非常重要的激素。在卵泡临近成熟时，孕酮增加，促使LH达到峰殖，引起排卵。Liu等[4]对鸡卵泡LHR基因表达量进行研究，发现鸡LWF到SYF中LHR mRNA表达量升高，F5级卵泡迅速下降，然后逐渐升高至F1级卵泡达到最高。周等研究显示从小卵泡到F1级卵泡颗粒细胞层LHR mRNA是逐渐增高，但是膜层没有显著变化[5]。本实验中，LHR mRNA表达量在F5级卵泡最高，与一些学者的研究结果不完全一致。但总体上籽鹅等级卵泡LHR表达量显著高于等级前卵泡，提示LH对禽类卵泡的作用主要是与等级卵泡LHR结合，进而促进卵泡细胞增殖和排卵。

雌激素受体的两种亚型ERα和ERβ，目前已知卵巢中ERβ的表达量高于ERα，属于优势表达的雌激素受体。本实验结果显示从LWF到F3级卵泡ERα mRNA表达量逐渐升高，F2、F1级卵泡表达量降低，提示ERα可能部分介导雌激素在卵泡生长发育中的作用。Couse等研究发现，雌激素可与ERβ结合使FSH发挥促进颗粒细胞分化的作用，且ERβ缺失鼠排卵前卵泡存在结构缺陷[6]，这些都提示ERβ对于雌激素发挥功能非常重要。等级前卵泡ERβ mRNA表达量较高，而等级卵泡ERβ表达量低，这提示雌激素作用到等级前卵泡时可能主要与ERβ结合，在等级卵泡的选择中发挥作用。此外，我们也发现在最大排卵前卵泡(F1级卵泡)雌激素两种受体表达量都非常低，这与禽类排卵前的雌激素分泌水平一致。

生长激素可以影响卵母细胞成熟，增加卵泡生成过程中对促性腺激素应答的受体表达量[5]。资料显示，GHR缺陷鼠排卵率和窦卵泡数量降低，闭锁卵泡数量增加，说明GH对卵巢可能具有直接作用；与切除卵巢鼠再进行雌激素诱导相比较，GHR基因敲除鼠血液指标对促性腺激素LH的反应性下降[7]，这也提示GHR在细胞对LH的反应性方面具有重要作用。本研究发现，F2级卵泡GHR mRNA表达量最高，LHR表达量也最高，这与Sirotkin和Chandrashekar等的研究结果一致。而资料显示的GHR缺陷的鼠闭锁卵泡数量增加，本研究中发现SYF和LWF中GHR表达量相对较低，这与禽类在小卵泡发育阶段细胞凋亡率较高，而到等级卵泡阶段凋亡率较低的现象一致。

尽管研究显示GH对卵巢可能具有直接作用[8]，但是较多研究仍显示GH对卵巢的作用更多是间接的，主要是通过IGF-1进行作用。IGF-1能参与调节鸡等级前卵泡正常启动、生长、发育、优势卵泡选择、排卵等活动，IGFBP-1则主要与IGF结合进而调节IGF的功能[9]。对体外培养的牛卵泡颗粒细胞进行实验，发现IGF-1可以剂量依赖式的增加颗粒细胞DNA含量，但是这种作用可以被IGFBP-1抑制[10]。本实验中SYF和LWF中IGFBP-1表达量非常低，提示其对IGF-1的抑制作用影响较小，也说明等级前卵泡快速增殖阶段IGF-1也发挥了较大的作用，这与Zaczek等的研究结果一致。而贾等研究表明，IGF-I能显著提高等级前SYF颗粒层和膜层的厚度以及细胞密度，这与本实验等级前卵泡IGFBP-1表达量低是一致的[11]。F5到F3级卵泡IGFBP-1表达量较高，说明其对IGF-1的抑制作用增强，但是F5到F3级卵泡颗粒细胞层厚度逐渐增加，这与IGFBP-1的高表达是不一致的，这可能是由于等级卵泡颗粒细胞的增殖受到多种因素调节，IGFBP-1在等级卵泡颗粒细胞增殖的调节中并未起到主要作用或者IGFBP-1对等级卵泡有其他途径的作用，具体原因有待于深入研究。

本研究建了不同等级卵泡生殖相关激素受体FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR、IGFBP-1 mRNA表达量的基础数据，为研究禽类产蛋机制奠定基础。

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国家自然科学基金项目资助(31302052)；黑龙江省自然科学基金项目(C180103)

2015-07-07 【修回日期】2016-06-28

S83

A

1000-6834(2017)01-057-04

△【通讯作者】Tel: 0459-6819201； E-mail: yanghuanmin@aliyun.com