低氧环境对高原鼢鼠不同组织VEGF165b基因表达量及微血管密度的影响*

赵伟民， 贾桂花， 周婷婷， 拉毛吉

(1． 青海大学生态环境工程学院， 西宁 810016； 2． 天祝县赛什斯教育辅导站， 甘肃武威 733209)

低氧环境对高原鼢鼠不同组织VEGF165b基因表达量及微血管密度的影响*

赵伟民1△， 贾桂花2， 周婷婷1， 拉毛吉1

(1． 青海大学生态环境工程学院， 西宁 810016； 2． 天祝县赛什斯教育辅导站， 甘肃武威 733209)

目的：探讨高原低氧环境下高原鼢鼠不同组织血管内皮生长因子165b(VEGF165b)表达量及微血管密度(MVD)的变化。方法：克隆高原鼢鼠VEGF165b基因并测定其在不同海拔脑、肺和骨骼肌组织内的表达量；免疫组化法观察脑、肺和骨骼肌组织内微血管并测定其在不同海拔组织内的密度。结果：高海拔VEGF165b表达量显著低于低海拔表达量(P<0.05)；微血管密度随海拔高度升高而增加(P<0.05)。结论：VEGF165b基因调节动物组织微血管密度是高原动物适应低氧环境的重要机制之一。

高原鼢鼠；血管内皮生长因子165b；微血管密度

myospalaxbaileyi； VEGF165b； MVD

【DOI】 10.12047/j.cjap.5368.2017.017

高原鼢鼠(myospalaxbaileyi)是青藏高原特有的小型啮齿动物，终生生活在封闭的地下洞道环境中，长期低氧环境促使高原鼢鼠在形态结构、生理指标及基因表达调控等方面形成了有利于其生存的一系列适应性机制。

微血管是血液与组织间进行物质交换的场所，微血管密度(microvessel density，MVD)增加是机体适应低氧环境的重要机制之一。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是动物组织调节血管生长的重要因子之一，其mRNA前体内源性剪切6～8外显子后产生多个亚型；其中VEGF165是体内最多、活性最强的亚型。VEGF165在体内剪切外显子8后形成促进微血管生成的VEGF165a和抑制微血管生成的VEGF165b[1,2]。目前，有关VEGF165b的研究报道主要集中在其与肿瘤的关系上，低氧如何通过调节VEGF165b基因表达从而调节MVD使高原土著动物适应低氧环境尚未有研究报道。因此克隆高原鼢鼠VEGF165b基因序列并研究不同低氧环境条件下该基因mRNA的表达量以及其与MVD之间的关系，将有助于进一步阐明高原鼢鼠对低氧环境的适应机制，也有助于揭示高原土著动物的低氧适应机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

高原鼢鼠来自于青海省门源县(海拔约3 200 m)和贵德县拉鸡山顶(海拔约4 000 m)。

1.2 实验方法

1.2.1 VEGF165b基因mRNA在脑、肺和骨骼肌组织中表达量的测定 按照RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明，分别提取生活于不同海拔环境条件下的高原鼢鼠脑、肺和骨骼肌组织内总RNA，并采用cDNA反转录试剂盒(TaKaRa)制备cDNA用于基因克隆和实时荧光定量PCR。

从NCBI上下载家鼠和人VEGF165b基因的编码序列，利用DNAMAN 软件进行对比分析后用 primer premier 5.0软件设计克隆高原鼢鼠VEGF165b基因片段的特异性引物。使用EX TaqTM(TaKaRa)制备的肺组织cDNA及合成的引物(TaKaRa)克隆高原鼢鼠VEGF165b目的基因片段，PCR扩增反应条件：95℃ 5 min，(95℃ 30 s、57.2℃ 30 s、72℃ 30 s)，35个循环，72℃ 5 min。克隆产物经电泳回收、转化后测序。测序结果经NCBI数据库Blast对比后，用DNAMAN软件进行序列分析。高原鼢鼠VEGF165b基因克隆引物(表1)。

利用测序结果设计VEGF165b基因荧光定量引物，同时用 primer premier 5.0设计内参基因β-actin的引物。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)用双标准曲线法进行实时荧光定量PCR，PCR扩增程序：95℃ 30 s、(95℃ 5 s、60℃ 30 s)40个循环。实时荧光定量PCR后用目的基因的浓度对数除以内参基因的浓度对数，换算出VEGF165b基因在不同海拔条件下三种组织内的相对表达量。实时荧光定量PCR引物(表1)。

Tab. 1 Names and sequences of primers

CP： Cloning primer； FQP： Fluorescent quantitative primer; VEGF: Vascular endothelial growth factor

1.2.2 免疫组化法检测MVD 三种组织用4%多聚甲醛室温固定24 h后制成常规石蜡切片，切片厚度4 μm。切片常规脱蜡水化、除去内源性过氧化氢酶、微波修复抗原、5% BSA封闭液室温封闭20 min后，滴加CD34兔抗大鼠多克隆抗体(1∶100稀释)4℃过夜；第2天切片恢复室温后，滴加生物素化山羊抗兔 IgG(1∶40稀释)室温孵育20 min，滴加 SABC室温孵育20 min，DAB 显色后用苏木精复染；再用1% 盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，吹干后中性树胶封片并观察。检测时CD34标记的棕黄色显示为微血管内皮细胞，苏木精染色的蓝色显示为细胞核。

MVD的测定参照Weidner的方法进行[3]：每张切片在200倍光镜下选择3个热点区视野计数微血管，计数后取平均值作为MVD。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 VEGF165b基因在不同海拔高原鼢鼠脑、肺和骨骼肌组织中的表达水平

2.1.1 目标片段克隆及测序结果 VEGF165b基因扩增片段在150 bp 附近有条带，与设计片段长度相符(图1)。克隆所得产物测序结果：GGCTAGAAAATCACTGTGAGCCTTGCTCAGA GCGGAGAAAGCATTTGTTTGTCCAAGATCCGCAGACGTGTAAATG TTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTG AGTTAAACGAACGTACTTGCAGATCTCTCACC。

克隆所得序列与GenBank中小鼠、大鼠和人的VEGF165b基因的同源性达到98%以上，说明克隆的基因片段是高原鼢鼠VEGF165b基因片段。用DNAMAN软件进行序列分析，发现543～564碱基位点中高原鼢鼠VEGF165b与VEGF165a有6个不同碱基，VEGF165b基因543、557、559、560、563及564位碱基分别是A、C、C、T、C、C, VEGF165a基因在这些位点的碱基分别是G、G、G、A、A、G。

Fig. 1 PCR products in lung tissue M: Marker； 1-4 lanes: PCR products

2.1.2 不同海拔高原鼢鼠脑、肺和骨骼肌组织中VEGF165b基因的表达水平 不同海拔生活的高原鼢鼠VEGF165b基因的相对表达量差异显著，高海拔高原鼢脑和肺组织内VEGF165b基因的相对表达量显著低于低海拔高原鼢鼠(P<0.01)，骨骼肌组织内相对表达量高海拔高原鼢鼠低于低海拔高原鼢鼠(P<0.05)。此外，VEGF165b基因相对表达量在不同的组织中表达有差异性(P<0.05,表2)。

Tab. 2 Relative expression of VEGF165bgene and MVD of different tissues at different altitudes

GroupAltitude(m)RelativeexpressionamountMVD(number/mm2)Brain32001.045±0.053699.51±55.5745000.907±0.027**849.92±111.95*Lung32001.061±0.0683591.79±287.9745000.932±0.033**4491.15±667.47*Skeletalmuscle32001.002±0.1181087.19±45.5345000.938±0.033*#1329.14±60.20*

VEGF: Vascular endothelial growth factor; MVD: Microvessel density

*P<0.05,**P<0.01vs3 200 m groups；##P<0.05vsbrain and lung 4 500 m groups

2.2 不同海拔高原鼢鼠脑、肺和骨骼肌组织MVD

图2显示了不同海拔生活高原鼢鼠脑、肺和骨骼肌组织内微血管内皮细胞。不同海拔生活的高原鼢鼠三种组织内MVD差异显著，高海拔生活的高原鼢鼠组织内MVD高于低海拔生活的高原鼢鼠(P<0.05)，其中骨骼肌组织内MVD高海拔显著高于低海拔(P<0.01，表2)。

Fig. 2 Immunohistochemical staining of different tissues at different altitudes

3 讨论

已有研究显示，高原鼢鼠骨骼肌中MVD显著高于SD大鼠[4]，地下鼠骨骼肌中MVD比大鼠高2倍，VEGF165amRNA表达水平比大鼠高1.6倍[5，6]，低氧训练促使SD大鼠肌肉MVD显著增加[7，8]，低氧促使Wistar大鼠脑组织VEGF表达量增加[9]；这些研究揭示了MVD影响着动物组织摄取氧的能力，同时也揭示了VEGF165a对微血管生长的调控作用受环境氧分压的影响。国外研究显示VEGF165b在正常组织中表达量高于肿瘤组织，并且可以抑制裸鼠移植瘤生长和新生血管生成[10-12]。本研究显示，高海拔生活的高原鼢鼠脑、肺和骨骼肌组织内VEGF165b相对表达量显著低于低海拔同组织内的表达量，高海拔生活的高原鼢鼠脑、肺和骨骼肌组织内MVD高于低海拔相同组织，这与肿瘤组织内VEGF165b表达量低于正常组织且微血管密度受VEGF165b抑制相一致，揭示了组织中微血管密度的生长、VEGF165b的表达及VEGF165b对微血管生长的调控受环境氧含量的影响，同时也揭示了VEGF165b是MVD重要的调控因子之一。

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青海大学中青年科研基金项目(2012-QNT-2)

2015-10-26 【修回日期】2016-09-06

R364.4

A

1000-6834(2017)01-068-03

△【通讯作者】Tel： 13709741936； E-mail： zhaoweimin1975@hotmail.com