低氘环境对胃癌细胞生长影响的体外实验*

吴 涛， 段晓剑， 田 宇， 陈海旭， 徐志宏， 刘 静，王卫华， 朱玲玲， 王刚石△

(1. 解放军总医院南楼消化科， 2. 解放军总医院老年医学研究所， 衰老及相关疾病研究北京重点实验室， 北京 100853；3. 江苏华益科技有限公司， 江苏 苏州 215500； 4. 军事医学科学院基础医学研究所， 北京100850)

低氘环境对胃癌细胞生长影响的体外实验*

吴 涛1， 段晓剑1， 田 宇1， 陈海旭2， 徐志宏3， 刘 静2，王卫华1， 朱玲玲4△， 王刚石1△

(1. 解放军总医院南楼消化科， 2. 解放军总医院老年医学研究所， 衰老及相关疾病研究北京重点实验室， 北京 100853；3. 江苏华益科技有限公司， 江苏 苏州 215500； 4. 军事医学科学院基础医学研究所， 北京100850)

目的：研究低氘环境对人胃癌细胞(SGC-7901)增殖的影响并初步探讨其相关机制。方法：用含不同氘浓度的蒸馏水(实验组：25 ppm；对照组：150 ppm)配制的RPMI-1640培养基培养胃癌细胞SGC-7901。分别在不同的时间点对两组细胞的增殖率、细胞周期及凋亡情况进行检测，用Western blot法对两组细胞的增殖细胞核抗原蛋白(PCNA)的表达进行检测。结果：低氘环境下SGC-7901细胞的增殖率比对照组低10%左右。低氘环境对细胞的划痕愈合能力及集落形成能力也有显著抑制作用(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，低氘组的细胞G1期细胞的比例增加(P<0.01)，而其所处S期细胞的比例下降(P<0.05)，两组细胞间早凋及晚凋比率差异无统计学意义。Western blot 的结果显示低氘环境下培养的胃癌细胞的PCNA的表达明显下降。结论：低氘环境能够抑制胃癌细胞的生长，这可能与低氘环境下胃癌细胞阻滞于G1期及下调其PCNA的表达有关。

低氘环境；胃癌；增殖；PCNA；细胞周期；凋亡

【DOI】 10.12047/j.cjap.5448.2017.001

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，2008年相关调查数据显示，其发病率和死亡率位居恶性肿瘤的第3位和第4位[1,2]。目前，除了常规的治疗手段外，人们在不断探索治疗胃癌的新方法。

是自然界存在的氢的稳定同位素，地表水中氘/氢(D/H)大约为1∶6 600，自然水中氘的含量约为0.0150%(150 ppm)，通常把水中氘含量低于150 ppm的水称为低氘水(deuterium-depleted water, DDW)[3,4]。有关研究表明，氘在小鼠的组织及血浆中的含量分布不均匀(血浆多于组织)[5]。饮水中氘元素的含量对生物体的生长发育有着重要影响，氘元素能够维持正常细胞的生长，而低氘环境对肿瘤细胞蛋白质及核酸的合成、细胞分裂有抑制作用[6,7]。随着对氘研究的逐步深入，高浓度氘对生物的反向作用也逐渐被报道。人们发现降低自然水中氘含量的65%，具有抑制多种肿瘤细胞生长的作用[8]。随后，相关临床试验也证明，在常规使用抗癌药物的基础上联合使用低氘水能够有效的延长肺癌、乳腺癌、前列腺癌患者的生存期[9-11]。然而，低氘环境对胃癌细胞增殖的影响却鲜有报道，为此本研究初步探讨低氘环境对人胃癌细胞(SGC-7901)增殖的影响及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料与分组

通过精馏的方法从自来水中制备低氘水[11]。将氘含量调整为25 ppm(实验组)及150 ppm(对照组)，但调整水中18O的浓度保持一致(0.198%)。SGC-7901细胞由解放军总医院老年医学消化科实验室提供，RPMI-1640培养基购自Gibco公司，鼠抗人PCNA单克隆抗体购自Abacm公司。

1.2 细胞增殖实验

将处于对数生长期的SGC-7901细胞以1×103cells/100 μl的浓度接种于96孔板，每组设5个复孔。将细胞分别加入50 ppm、100 ppm和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培养基并置于37℃、5% CO2的培养箱中培养48 h，取出96孔板，每孔中加入10 μl CCK-8反应液，37℃下避光孵育1 h，用酶标仪在450 nm波长下检测各组的OD值。根据以上预实验结果，各组浓度氘环境培养的细胞在48 h时的OD450值差异无统计学意义(50 ppm, 0.439±0.013; 100 ppm, 0.433±0.016; 150 ppm, 0.435±0.013;n=5)。因此本实验将25 ppm及150 ppm浓度分别作为实验组及对照组所用氘浓度进行后续的实验。分别将细胞在25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培养基中培养24 h、48 h、72 h、96 h，用酶标仪在450 nm波长下检测各组的OD值。

1.3 细胞划痕实验

将处于对数生长期的SGC-7901细胞以5×105cells/ml的浓度接种于6孔板，常规培养至细胞达到95%～100%融合。用10 μl枪头以垂直于6孔板底部方向直线划痕。随后将细胞用PBS洗3次以去除划下的细胞。实验组及对照组分别加入25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培养基并置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。用细胞划痕实验检测两组胃癌细胞的迁移能力，分别在培养的0 h、24 h、48 h拍照，用同一标尺测量不同时间点两组细胞划痕的宽度，设0 h时划痕宽度为1，以此计算出24 h、48 h时划痕的相对宽度。

1.4 集落形成实验

将处于对数生长期的SGC-7901细胞以500 cells/well分别接种于6孔板中，每组分别设置3个复孔。实验组及对照组分别加入25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培养基并置于培养箱中培养14 d，直至肉眼可见的集落形成时终止培养。每孔加入2 ml 4%多聚甲醛固定液并于4℃条件下固定20 min。弃掉固定液，加入结晶紫染液染色30 min，去离子水洗掉浮色，置于空气中干燥。显微镜下拍照并对每孔中的集落数进行统计分析。

1.5 细胞周期检测

实验组及对照组细胞分别用25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培养基培养48 h，收集两组细胞并将其浓度调整为2×106cells/ml。用70% 的乙醇在4℃条件下固定细胞2 h。细胞以1 000 r/min 离心5 min，用PBS清洗2次。弃掉上清液并加入1 ml RNAse溶液，将其置于37℃下反应30 min。溶液冷却至室温后，每组离心管中加入0.1 ml PI染液，避光保存并用流式细胞仪检测。

1.6 细胞凋亡检测

实验组及对照组细胞分别用25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培养基培养48 h，在冰上收集各组的培养上清及细胞，用低温离心机在4℃条件下2 000 r/min 离心3 min，用4℃ PBS清洗细胞1次。结合缓冲液清洗细胞并将其浓度调整为(1～5)×106cells/ml。取100 μl细胞悬液并加入5 μl Annexin V荧光染料，室温孵育10～15 min。用结合缓冲液清洗细胞并用200 μl 的结合缓冲液重悬。加入5 μl PI染色液，4℃避光保存并上机检测。

1.7 PCNA蛋白检测

将处于对数生长期的SGC-7901细胞以3×105cells/ml的密度接种于6 cm细胞培养皿中，实验组及对照组细胞分别用25 ppm DDW和150 ppm DDW配制的RPMI-1640培养基培养48 h。收集细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，在4℃条件下，12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法蛋白定量。以每孔100 μg蛋白上样，浓缩胶60 V，40 min，分离胶100 V，90 min，直至蓝色条带到凝胶底端。蛋白电泳分离后，设定100 V，转膜2 h。室温下用10%脱脂奶粉(TTBS)封闭2 h，洗膜2次，每次5 min。加入PCNA一抗(1∶500)，β-actin一抗(1∶1 000)，4℃过夜。TTBS洗膜3次，每次10 min。加入适当稀释浓度二抗(1∶1 000)室温下孵育2 h。弃掉未结合的二抗，TTBS洗膜3次，每次10 min。最后于暗室中显影。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 低氘环境对胃癌细胞增殖的影响

CCK-8法检测低氘环境对人胃癌细胞增殖的影响，与150 ppm组相比，25 ppm浓度氘环境培养的细胞在48 h的OD450值显著降低，将胃癌细胞置于25 ppm及150 ppm氘浓度环境下培养24 h, 48 h, 72 h 及 96 h，25 ppm浓度氘环境对胃癌细胞增殖的抑制率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，表1)。

2.2 低氘环境对胃癌细胞的迁移能力的影响

25 ppm组细胞划痕宽度在24 h、48 h时分别为0.790±0.017、0.569±0.047,与150 ppm组相比(0.607±0.022、0.419±0.034)，差异均有统计学意义(P<0.01，图1)

GroupOD45024h48h72h96h150ppm0.309±0.0090.312±0.0070.552±0.0080.915±0.05025ppm0.270±0.016**0.282±0.010**0.525±0.008**0.824±0.039*

*P<0.05，**P<0.01vs150 ppm group

2.3 低氘环境对胃癌细胞的集落形成能力的影响

集落形成实验检测长期低氘环境刺激对胃癌细胞增殖能力的影响。实验组与对照组集落数分别为234±19、327±13，25 ppm低氘环境下细胞集落数较对照组明显减少(P<0.01，图2)。

2.4 低氘环境对胃癌细胞周期的影响

流式细胞术检测低氘环境对胃癌细胞周期的影响。与对照组相比，实验组细胞的细胞周期阻滞于G1/S期，表现为S期细胞的比率减少(25 ppm，27.98%±3.77%；150 ppm， 39.83%±1.99%；P<0.05)G1期细胞的比率增多(25 ppm，57.81%±5.63%；43.77%±6.176%；P<0.01)。两组间G2期细胞的比率差异无统计学意义(图3)。

2.5 低氘环境对胃癌细胞凋亡的影响

流式细胞术检测低氘环境下胃癌细胞的早期凋亡及晚期凋亡情况。实验组及对照组细胞的早期凋亡比率分别为1.593%±0.206%、1.290%±0.053%，晚期凋亡比率分别为1.907%±1.068%、1.757%±1.097%，两组细胞早凋及晚凋比率差异无统计学意义。实验组与对照组死亡细胞的比率分别为3.500%±1.274%、3.047%±1.111%，差异无统计学意义(图4)。

2.6 低氘环境对胃癌细胞PCNA蛋白表达的影响

PCNA是反映肿瘤细胞增殖状态的良好指标，结果显示，实验组胃癌细胞PCNA蛋白的表达量较对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05,图5)。

3 讨论

目前，临床上对胃癌的治疗效果远不尽人意。近几年，越来越多的研究结果表明降低水中氘元素的含量能够抑制多种肿瘤细胞的生长[12,13]。然而，关于低氘水对胃癌细胞增殖的影响却鲜有报道。本研究发现，低氘环境能够通过下调PCNA的表达及阻滞细胞周期来抑制胃癌细胞生长。由于胃粘膜能够直接与低氘液体(如低氘水)接触，因此这一发现有望成为治疗胃癌的新策略。

相关研究证明，低氘水对胃癌细胞生长的抑制率高达20%，其抑制效果在不同的作用时间点各有差异。Cong 等人[8]提出，短时间接触低氘环境(50 ppm)能够抑制肺癌细胞的增殖，随后细胞恢复正常生长，继而随着接触时间的延长，肺癌细胞又被抑制增殖。本研究中发现50 ppm及100 ppm浓度的低氘环境并不能抑制胃癌细胞增殖。25 ppm至105 ppm浓度范围内的低氘环境对生物体无毒副作用[10,17]。因此，本研究将氘浓度降低至25 ppm并且观察到了其对胃癌细胞增殖的抑制作用。与其他相关研究相比，本研究中低氘环境对胃癌细胞增殖的抑制率为10%左右，这可能与研究者所用的细胞系及实验设计有关。与其它研究不同，本研究在制备低氘水时严格控制了水中其他元素(如18O等)的含量，以此排除氘元素以外其他因素对胃癌细胞增殖的影响。因精馏法制备低氘水时，水中的18O及其他微量元素和电解质的含量也会随之改变，因此选择了150 ppm自然水而不是蒸馏水作为实验的对照组。

本文初步探索了低氘环境抑制胃癌细胞增殖的相关机制，例如细胞周期、凋亡等。发现低氘环境能够使胃癌细胞停留于G1期。相关研究也表明，细胞的分裂增殖与细胞内环境的改变及氘元素的含量密切相关[14, 15]。此外，细胞中D/H比值的增高可诱导细胞进入S期[16]，与以上研究结果一致。本实验揭示了低氘环境能够降低S期胃癌细胞的比率。这可能与低氘环境改变了胃癌细胞的生长环境，影响细胞内D/H的比率，进而调整细胞周期相关信号源诱导细胞发生一系列生理改变有关。此外，相关研究表明，低氘水能够诱导细胞凋亡，这可能与下调C-myc, Ha-ras 及P53基因的表达有关，但其具体作用机制目前尚无定论[17]。然而，本研究中我们并没有观察到低氘环境诱导胃癌细胞凋亡的现象，这可能与本研究中所使用的细胞系有关。

PCNA是细胞增殖周期中S期细胞的细胞核中表达的抗原，因其在多种肿瘤细胞中高度表达且与DNA的复制、修复及细胞周期调控蛋白的表达密切相关，因此常作为评定肿瘤的进展及临床预后的指标[18,19]。本研究发现25 ppm低氘环境能够下调胃癌细胞中PCNA蛋白的表达，这与本研究中实验组胃癌细胞被阻滞在G1期这一结果相吻合，但还需要更深入的研究其相关机制。

综上所述，低氘环境下培养的胃癌细胞的生长周期能够被有效阻滞，胃癌细胞的生长受到抑制，这可能与低氘环境能够通过下调PCNA的表达、阻滞细胞周期抑制胃癌细胞的增殖有关。这一发现为实现新的胃癌治疗策略提供了理论依据。

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Deuterium depleted environment inhibits the growth of gastric cancer cells： in vitro study

WU Tao1, DUAN Xiao-jian1, TIAN Yu1, CHEN Hai-xu2, XU Zhi-hong3,LIU Jing2, WANG Wei-hua1, ZHU Ling-ling4△, WANG Gang-shi1△

(1. Department of Geriatric Gastroenterology, Chinese PLA General Hospital, 2. Institute of Gerontology and Geriatrics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853; 3. Jiangsu Huayi Technology Co. Ltd, Suzhou 215500; 4. Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850, China)

Objective: To examine whether deuterium depleted environment may affect the biological features of human gastric cancer cells(SGC-7901)and explore the possible underlying mechanisms. Methods: SGC-7901 cells were cultured in RPMI-1640 medium prepared with distilled water of different deuterium concentrations(experimental group: 25ppm deuterium ；control group:150ppm deuterium). Assays on cellular proliferation, cell cycle and apoptosis were conducted at different time points and comparison. The protein expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was measured using Western blot. Results: In contrast to 150ppm group, the proliferation rate of SGC-7901 cells in 25ppm deuterium was decreased by 10% as indicated by the CCK-8 assay. Wound healing ability and the colony formation ability of these cells were also significantly suppressed (P<0.05). Flow cytometry analysis further revealed that exposure to 25ppm significantly increased the ratio of cancer cells at G1 phase (P<0.01) while decreased the ratio at S phase (P<0.05) compared to the 150ppm group. There was no significant difference in apoptosis between the two groups. Down-regulated expression of PCNA was also identified in cancer cells treated with 25ppm deuterium. Conclusion: Deuterium depleted environment inhibited the proliferation of gastric cancer cells, which may be attributed to the down-regulation of PCNA and cell cycle arrest at G1 phase.

deuterium depleted environment； gastric cancer； proliferation； PCNA; cell cycle; apoptosis

2016-04-28

2016-10-24

R453.9

A

1000-6834(2017)01-001-05

△【通讯作者】Tel: 010-66876245，010-66931315; E-mail: wanggangshi@hotmail.com，linglingzhu@hotmail.com