裸鼠鼻咽癌种植瘤微波消融实验研究

张艳敏， 邴婧毓， 周广骞， 郭文龙

（1内蒙古自治区呼伦贝尔市第二人民医院 内科，内蒙古 呼伦贝尔162650；2佛山市中医院，广东 佛山 528000）

裸鼠鼻咽癌种植瘤微波消融实验研究

张艳敏1*， 邴婧毓2， 周广骞1， 郭文龙1

（1内蒙古自治区呼伦贝尔市第二人民医院 内科，内蒙古 呼伦贝尔162650；2佛山市中医院，广东 佛山 528000）

目的 建立裸鼠皮下种植人源鼻咽癌CNE－2模型，模拟姑息性微波消融术，观察消融术后残瘤组织中反映细胞侵袭转移能力的指标 （MMP－9）变化状况。方法 建立裸鼠皮下种植人源鼻咽癌CNE－2动物模型，术后48小时处死动物，解剖肿瘤组织，进行HE染色病理检查以及MMP－9与HSP90免疫组化检测，通过与对照组比较，观察消融术对鼻咽癌CNE－2肿瘤残瘤组织MMP－9与HSP90蛋白表达的影响。结果 消融术后48小时，与未消融肿瘤组织比较，残瘤组织MMP－9表达降低，而HSP90表达升高，差异均有统计学意义 （P<0.05）。结论 裸鼠种植瘤消融术后48小时的残癌组织MMP－9表达降低，提示残瘤组织侵袭能力可能一过性减弱；HSP90表达升高，可能与瘤细胞受热刺激应激保护有关。

鼻咽癌；微波消融；残瘤；增殖；侵袭

鼻咽癌 （nasopharyngeal carcinoma，NPC）是中国南方地区常见恶性肿瘤之一，约50%以上患者确诊时已发生远处淋巴结转移，其致瘤性和高度转移性是目前鼻咽癌治疗最难攻克的难关。晚期鼻咽癌患者主要出现肝转移和骨转移［1］，可采用微波凝固热消融进行治疗。微波凝固热消融是近年发展起来的一种治疗恶性肿瘤的新技术，具有凝固范围可靠、疗效确切、无严重并发症等特点，日益应用于肿瘤治疗，但鼻咽癌肝脏转移瘤消融术后的残瘤组织细胞生长特性是否发生变化以及如何变化仍无统一定论。本研究通过建立裸鼠皮下种植人源鼻咽癌CNE－2模型，模拟姑息性微波消融术，对消融术后残瘤组织进行免疫组化检测，观察残瘤组织中反映细胞侵袭转移能力的指标的变化状况，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验设备与材料

1.1.1 实验设备 微波消融仪器 （南京庆海微波电子研究所），功率范围为 0～100 W；恒温水浴箱 （上海之信仪器有限公司）；细胞培养箱：美国Thermo二氧化碳细胞培养箱；水平离心机 （湖南湘仪离心机仪器有限公司）。

1.1.2 实验材料 ①雌性BALB／C裸鼠6只，4周龄，体重约15～20 g，购自广东省动物实验中心；②细胞株：取对数生长期的人鼻咽癌细胞株CNE－2；③主要试剂：抗HSP90小鼠单克隆抗体：Abcam，Inc；抗MMP－9抗体：Santa Cruz Biotechnology，Inc；胎牛血清：杭州四季清生物工程材料有限公司；胰蛋白酶（0.25%Trypsin－EDTA）：Gibco Inc；PBS：美国Hyclone公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将6只接种人鼻咽癌CNE-2细胞的荷人鼻咽癌裸鼠随机分成两组：对照组 （3只）、实验组 （3只）。

1.2.2 实验步骤 ①细胞复苏：液氮罐取出细胞冻存管并置于37℃水浴锅中，均匀摇动，细胞解冻；离心后弃上清液，并加入培养液重悬细胞，将培养瓶置于CO2培养箱中培养。②细胞培养：将鼻咽癌CNE-2细胞置于RPMI-1640培养液中，并放置在5%CO2、37℃培养箱中。③荷CNE-2鼻咽癌细胞裸鼠模型建立：待细胞生长至对数生长期时，对裸鼠左侧腹股沟-左侧侧腰部皮肤进行消毒，距接种点约1～1.5 cm进针，皮下注射0.15 mL细胞悬液 （细胞细胞数1.0×107／mL）。④微波消融：荷瘤裸鼠生长约3周后，肿瘤长径约0.6～0.8 cm，消融功率选用40 W，时间20 s；消融术后，荷瘤裸鼠返回动物房饲养。⑤肿瘤标本病理检测：荷瘤裸鼠消融术后48小时，处理动物（包括对照组），外科手术取出肿瘤，石蜡包埋，切片，HE染色，MMP-9和HSP90免疫组织化学检测。⑥免疫组化结果判定：设阳性对照及PBS代替一抗作为阴性对照。若细胞核 （或细胞浆）出现棕褐色物质，则为阳性细胞 （MMP-9蛋白表达主要位于细胞核，HSP90蛋白表达主要位于细胞质中）。每个肿瘤标本选取1张白片进行免疫组化检测，每张切片在高倍光学显微镜 （200×）下随机选择 5个视野，进行阳性细胞计数。MMP-9和HSP90阳性标准：阳性染色为在细胞膜或／和胞浆有棕黄色颗粒沉着。评分标准：根据阳性细胞数与细胞膜 （或细胞浆）的染色程度所占百分比进行评分：着色深 （2分），着色淡 （1分），基本不着色 （0分）；着色细胞占所计数细胞数百分比：＞50% （3分），26%～50% （2分），5%～25% （1分），＜5% （0分）。最终分数 =每张切片着色程度分值 ×着色细胞百分比分值。最终分数：4分及以上为强阳性 （＋＋），2～3分为阳性 （＋），0～1分为阴性 （-）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件分析实验数据，计数资料采用两独立样本秩和检验，P＜0.05为具有统计学差异。

2 实验结果

2.1 残癌组织病理观察

实验组荷瘤动物在进行肿瘤姑息微波消融术后48小时处死该裸鼠，取出残余肿瘤，固定包埋。残余肿瘤消融区肉眼呈圆锥形，消融边界清晰，消融炭化区呈褐色。

光镜下 （HE染色）可见 （见图1）：①消融区中央鼻咽癌细胞形态消失，间质细胞胞浆红染，胞核固缩，呈现完全性凝固性坏死。②残瘤边缘区可见鼻咽癌细胞形态正常，无细胞核固缩表现。

2.2 鼻咽癌残瘤与对照组肿瘤组织免疫组化结果

与未消融的对照组肿瘤组织 （见图2B）比较，消融术后48小时残瘤组织 （见图2A）MMP-9蛋白表达降低而HSP90蛋白表达升高： 阴性 （-）视野数为 18；强阳性 （＋＋）视野数为26。两独立样本秩和检验显示，鼻咽癌种植瘤消融后MMP-9与HSP90蛋白表达与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1 鼻咽癌消融术后2天残瘤HE染色 （×200）

图2 两种不同处理组织的MMP－9表达 （×400）

表1 鼻咽癌微波消融后残瘤组织MMP－9与HSP90蛋白表达与对照组比较 （n）

3 讨论

鼻咽癌为我国南方地区常见的恶性肿瘤之一，大多数患者在就诊时已发生颈部淋巴结转移或其它脏器多发转移，其致瘤性和高度转移性是目前鼻咽癌的治疗中最难攻克的难关。晚期鼻咽癌患者主要出现肝转移和骨转移，其中肝转移发生率为10%～36%［2-4］，而发生肝转移后患者的中位生存期仅3.2个月，亦有研究［3］表明有一定比例的鼻咽癌患者的死亡原因是肝转移。

微波消融治疗的实质为热疗，该疗法的原理是通过提升肿瘤微环境温度来杀伤肿瘤细胞。热刺激正常组织细胞或肿瘤细胞时，会诱导肿瘤细胞发生热休克应答，使肿瘤细胞分泌大量热休克蛋白。热休克蛋白对肿瘤细胞的作用主要包括两个方面：①肿瘤细胞发生初期维持其稳定性；②抵抗外界不良刺激。在对肿瘤组织进行微波热消融治疗过程中，热休克反应有利于保护肿瘤细胞，热休克蛋白几乎可以从现有的所有治疗肿瘤的过程中发挥保护肿瘤细胞的作用，可以说，热休克蛋白是肿瘤细胞自身保护的武器。

本实验结果显示，鼻咽癌瘤块姑息性消融术后，残瘤组织的HSP90蛋白表达增高 （P＜0.05），提示可能与残余鼻咽癌细胞受热刺激后保护自身、减少外界刺激的伤害有关。此外，HSP90抑制剂可增强肿瘤对放射治疗的敏感性，从而诱导肿瘤细胞凋亡。邵汛帆等［5］的研究对微波腔内热疗联合放射治疗鼻咽癌原发灶进行观察，结果显示，联合治疗可提高原发灶局部控制率。Li等［6］对18例鼻咽癌肝转移且行微波治疗的患者进行了回顾性分析，18例患者共24个肝转移灶，转移瘤大小约1.9～4.2 cm，共给予27次消融术，治疗后22.4个月的随访结果显示，4例患者出现新转移灶，其中肝内2例，并再次成功行微波治疗；3名患者于随访期内死亡。该研究结果提示微波消融术为治疗鼻咽癌肝内转移瘤的有效方法。

本实验对实体残瘤组织进行HSP90蛋白免疫组化检测，显示残瘤组织HSP90蛋白表达较对照组显著增高 （P＜0.05），与细胞实验热浴后48小时结果不同，考虑为细胞实验处于倍增期，虽然热刺激后HSP90蛋白表达很快升高，但经过48小时后，细胞已增殖，其基本生物特性已恢复常态，故其HSP90蛋白表达基本恢复正常。而组织中，细胞增殖慢，组织受强刺激后，HSP90仍在组织细胞中，故残瘤组织HSP90消融后48小时仍表现为HSP90蛋白高表达。

MMP-9是基质金属蛋白酶家族成员之一，可降解细胞外基质多种成分，如基底膜主要成分Ⅳ型胶原［7-8］。肿瘤细胞表达MMP-9与侵袭转移能力有关。一项关于乳腺癌的研究［9］显示，乳腺癌组织中MMP-9的表达量与乳腺癌分级呈密切的正相关关系。MMP与肿瘤侵袭转移关系密切，肿瘤在侵袭过程中，原发恶性肿瘤细胞进入与突破血管均需MMP降解血管基底膜，MMP为肿瘤细胞发生血源性远处转移的关键因素。此外，MMP-9在肿瘤组织周围血管亦高表达，提示血管生成的关键步骤与肿瘤侵袭的过程类似。相关实验研究［10-12］显示，MMP不单单对细胞外基质与蛋白进行降解，同时参与细胞增殖、凋亡、分化及血管生成。MMP通过降解ECM刺激机体释放bFGF，从而刺激血管生成。

本研究中，消融术后48小时残瘤组织与对照组比较，免疫组织化学显示消融后48小时残瘤MMP-9表达降低 （P＜ 0.05），而HSP90表达升高 （P＜0.05）。因此认为残瘤组织侵袭能力一过性降低，但是否存在1周或2周后残瘤组织侵袭能力增强，还有待于进一步研究。本研究存在一定的局限性：细胞蛋白质表达检测时间点可再增加，有利于动态观察鼻咽癌CNE-2微波消融术后不同时间点残癌组织中MMP-9与HSP90蛋白表达情况，有助于更深入观察残瘤的生物学特性。

本实验结果显示，消融术后48小时残癌组织MMP-9表达降低，提示残瘤组织侵袭能力一过性减弱的可能；HSP90表达升高，可能与瘤细胞受热刺激应激保护有关。

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（责任编辑：常海庆）

Experimental Study on Microwave Ablation of Transplanted Tumor of Nasopharyngeal Carcinoma in Nude Mice

ZHANG Yanmin1*,BING Jingyu2,ZHOU Guangqian1,GUO Wenlong1
(1Department of Internal Medicine,Hulun Buir Second People's Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region,Hulun Buir 162650, China;2Foshan Hospital of TCM,Foshan 528000,China;*

ZHANG Yanmin,E-mail:zhym93@163.com)

Objective To establish animal model of CNE-2 in nude mice,to simulate palliative microwave ablation and to observe the changes of invasion marker(MMP-9)in residual tumor after microwave ablation.Methods Animal model of CNE-2 in nude mice was established.The nude mice were sacrificed at 48 hours after microwave ablation for tumor tissue anatomy,HE staining pathological examination,MMP-9 and HSP90 immunohisto-chemistry detection.The effects of ablation on MMP-9 and HSP90 protein expressions in residual tumor of CNE-2 were observed and compared with those of control group.Results Compared with control group,the expression of MMP-9 in residual tumor at 48 hours after ablation decreased,but the expression of HSP90 in residual tumor increased,with statistical differences(P＜0.05).Conclusions 48 hours after ablation,MMP-9 protein expression in residual tumor decreases,which suggests that the invasive ability of remnant tumor decrease transiently;HSP90 protein expression in residual tumor increases,which may be related to tumor cells'stress protection induced by heat stimulation.

Nasopharyngeal carcinoma;Microwave ablation;Residual tumor;Proliferation;Invasion

R739.63

：A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.03.0332

2016－11－21

：2017-01-23

张艳敏 （1962－），女，山东龙口人，本科学历，主治医师，研究方向：肿瘤内科治疗。

*通讯作者：张艳敏，E-mail：zhym93@163.com。