RNAi技术干扰TGF-β/Smads表达对卵巢癌细胞株的影响作用

刘继红，冯小丽

（珠海市第二人民医院 产科，广东 珠海 519000）

RNAi技术干扰TGF-β/Smads表达对卵巢癌细胞株的影响作用

刘继红，冯小丽

（珠海市第二人民医院 产科，广东 珠海 519000）

目的 研究RNAi技术干扰TGF－β／Smads表达对卵巢癌细胞株的影响作用。方法 将卵巢细胞SKOV3细胞体外培养，随机分为对照组、空白载体组和siRNA干扰组。采用免疫组化法比较三组的TGFRβⅠ、TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7表达水平以及细胞生长速度、凋亡率。结果 siRNA干扰组的TGFRβⅠ、Smad7表达水平显著高于对照组和空白载体组 （P＜0.05），而TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表达水平低于对照组和空白载体组 （P＜0.05）。siRNA干扰组接种24 h、48 h和72 h时的吸光度显著低于对照组和空白载体组 （P＜0.05）。siRNA干扰组的细胞凋亡率显著高于对照组和空白载体组（P＜0.05）。结论 RNAi技术可干扰TGF－β／Smads表达，对卵巢癌细胞株的生长具有抑制作用。

RNAi；卵巢癌；TGF-β；Smads

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一，其病死率居妇科肿瘤的首位，严重威胁妇女的生命和健康［1］。由于卵巢位于盆腔深部，早期病变不容易及时发现，一旦出现症状，大多数癌症已到晚期，即使积极采取手术及术后辅助化疗，其5年生存率仍然只有25%～30%［2］。因此，必须寻求新的基础临床研究途径，卵巢癌的治疗才有可能取得新进展。有研究［3］表明，由Smads介导的转化生长因子β（TGF－β）通路是一条与卵巢癌发生和发展相关的信号转导通路。本研究通过RNA干扰技术，研究TGF－β信号通路对卵巢癌的影响，有助于从系统水平上进一步揭示卵巢癌发生和发展的分子机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3（上海中科院细胞库）；胎牛血清 （上海生工生物）；McCoy＇s 5A培养基 （Oxid公司）；siRNA oligo siRNA （上海生工生物）；lipofectamin 2000转染试剂 （上海生工生物）；鼠抗人、兔抗人单抗 （上海生工生物）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

SKOV3细胞由含10 μg／mL青霉素、10 μg／mL链霉素及10%胎牛血清的McCoy＇s 5A培养基培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 siRNA制备

将人TGFRβⅡ基因序列输入Ambion公司的siRNA软件设计程序， 给出引物由上海生工生物合成。 引物序列如下：Forward：5＇－GCCAGUACCUCAUGGAUUATT－3＇；Reverse：5＇－UAAUCCAUGAGGUACUGGTCT－3＇。

1.2.3 细胞转染

将siRNA加入McCoy's 5A培养基稀释为20 nmol／mL后孵育 5 min，加入 pofecamin 2000再孵育 20 min。将五万个SKVO3细胞接种于24孔板，24 h后转染。

1.2.4 免疫组化

用SP试剂盒进行免疫组化，当细胞浆／核中出现棕黄色颗粒则判定为阳性，染色强度分为三级：1级：1分，淡黄色；2级：2分，黄色；3级：3分， 棕黄色。0为阴性， 赋值0分。取5个视野的平均值为最终得分。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNAi技术干扰对卵巢癌细胞株TGF－β／Smads表达水平的影响

siRNA干扰组TGFRβⅠ和Smad7表达水平均显著高于对照组和空白载体组，TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表达水平均低于对照组和空白载体组，差异均具有统计学意义 （P＜0.05）。见表1。

表1 RNAi技术干扰对卵巢癌细胞株TGF－β／Smads表达水平的影响（±s）

表1 RNAi技术干扰对卵巢癌细胞株TGF－β／Smads表达水平的影响（±s）

组别 siRNA干扰组 空白载体组 对照组Smad2 1.01±0.02 2.54±0.07 1.52±0.05 Smad3 1.18±0.03 3.04±0.06 2.01±0.07 Smad4 1.70±0.05 4.03±0.09 2.01±0.06 Smad7 2.78±0.03 3.00±0.07 2.83±0.02 TGFRβⅠ 3.59±0.04 2.25±0.01 2.51±0.04 TGFRβⅡ 2.45±0.08 3.85±0.02 3.94±0.03

2.2 RNAi技术干扰对卵巢癌细胞株生长速度的影响

siRNA干扰组接种24 h、48 h和72 h时吸光度均显著低于对照组和空白载体组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。见表2。

表2 RNAi技术干扰对卵巢癌细胞株生长速度影响 （±s）

表2 RNAi技术干扰对卵巢癌细胞株生长速度影响 （±s）

时间 （h） siRNA干扰组 空白载体组 对照组24 0.204±0.012 0.378±0.021 0.356±0.021 48 0.323±0.021 0.495±0.023 0.511±0.039 72 0.356±0.022 0.814±0.022 0.832±0.035

2.3 RNAi技术干扰对卵巢癌细胞株凋亡水平的影响

流式细胞仪检测结果显示，siRNA干扰组的细胞凋亡率为（77.5±3.1）%，显著高于对照组的 （26.3±1.9）%和空白载体组的（27.3±2.0）%， 差异具有统计学意义 （t=17.11、16.42，P＜0.05）。

3 讨论

卵巢癌的发病机制尚未完全阐述清晰，但毋庸置疑的是，基因表达的失调是导致卵巢癌发生和发展的重要原因之一。TGF-β／Smads信号转导途径能够诱导生长抑制和凋亡反应。在肿瘤发生早期，TGF-β信号转导通路对肿瘤生长具有抑制作用；但对进展型和晚期肿瘤具有促进作用，并能增强其侵袭力和恶性程度［4-5］。TGF-β信号转导通路的配体、受体、细胞内信号转导分子Smad蛋白等组成一个肿瘤抑制通路，通路中任一环节异常都可引起信号转导通路紊乱而使细胞逃避TGF-β介导的生长抑制效应［5］，导致多种肿瘤发生。

张云艳等［3］的研究证实，在卵巢癌组织中TGFβR／Smads的表达存在紊乱，提示TGFβR／Smads在卵巢癌的发生中可能具有特定作用。因此，通过RNA干扰技术，研究TGF-β信号通路对卵巢癌发生、发展的影响，有助于从系统水平上进一步揭示卵巢癌发生、发展的分子机制。

本研究结果显示，siRNA干扰组TGFRβⅠ、Smad7表达水平均显著高于对照组和空白载体组 （P＜0.05），TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表达水平均低于对照组和空白载体组（P＜0.05）。王福玲等［6］在对子宫内膜样腺癌组织中 TGFβR／Smads通路各蛋白表达水平差异的研究中发现，与正常组织比较，肿瘤组织中的TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4存在过表达，而 TGFRβⅠ和 Smad7表达水平降低。在本研究中，RNAi干扰有效地降低了TGFRβⅡ表达水平，从而影响了整个通路的蛋白表达。进一步比较三组的细胞生长速率可知，siRNA干扰组接种24 h、48 h和72 h时吸光度均显著低于对照组和空白载体组 （P＜0.05），提示通过降低TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表达水平，提高TGFRβⅠ、Smad7表达水平，可以有效地降低卵巢癌细胞的生长速率。比较三组的细胞凋亡率可知，siRNA干扰组的细胞凋亡率显著高于对照组和空白载体组 （P＜0.05），进一步证实RNA干扰技术能够有效地降低肿瘤的生存能力。

综上所述，RNAi技术可干扰TGF-β／Smads表达，对卵巢癌细胞株的生长具有抑制作用。

[1]Huang Z,Gao Y,Wen W,et al.Contraceptive methods and ovarian cancer risk among Chinese women:a report from the Shanghai Women's Health Study[J].Int J Cancer,2015,137(3):607-614.

[2]Holschneider CH,Berek JS.Ovarian cancer:Epidemiology,biology, and prognostic factors[J].Semin Surg Oncol,2000,19(1):3-10.

[3]张云艳,李雪,隋丽华,等.卵巢癌中TGF-β/Smads信号通路的功能研究 [J].遗传学报,2004,31(8):759-765.

[4]Gao Y,Xie S,Wang Y,et al.A prescription of Jiashen reduces postinfarct left ventricular remodeling via inhibition of TGF-β/Smads signaling pathway[J].J Am Colle Cardiolo,2015,66(16):84.

[5]Jiang F,Mu J,Wang X,et al.The repressive effect of miR-148a on TGF beta-SMADs signal pathway is involved in the glabridin-induced inhibition of the cancer stem cells-like properties in hepatocellular carcinoma cells[J].PLoS One,2014,9(5):e96698.

[6]王福玲,韩雪川,赵兴波,等.子宫内膜样腺癌间质细胞和癌细胞TGFβR/Smads的表达 [J].山东大学学报:医学版,2008,46(10): 959-962.

（责任编辑：常海庆）

Effect of RNAi Technique on Ovarian Cancer Cell Lines by Interfering with the Expression of Smads/TGF-β

LIU Jihong,FENG Xiaoli
(Department of Obstetrics,Zhuhai Second People's Hospital,Zhuhai 519000,China)

ObjectiveTo study the effect of RNAi technique on ovarian cancer cell lines by interfering with the expression of TGF-β/Smads.Methods Ovarian SKOV3 cells were cultured in vitro and randomly divided into control group,empty vector group and siRNA interference group.The expression levels of TGFRβⅠ,TGFRβⅡ,Smad2,Smad3,Smad4 and Smad7,and cell growth rate and apoptosis rate were compared among three groups by immunohistochemistry.Results The expression levels of TGFRβⅠ and Smad7 of siRNA interference group were significantly higher than those of control group and empty vector group(P＜0.05),but the expression levels of TGFRβⅡ,Smad2,Smad3 and Smad4 were lower than those of control group and empty vector group(P＜0.05).The absorbance at 24 h, 48 h and 72 h in siRNA interference group were significantly lower than those in control group and empty vector group(P＜0.05).The apoptosis rate of siRNA interference group was significantly higher than those of control group and empty vector group(P＜0.05). Conclusions RNAi technique can interfere with the expression of TGF-β/Smads,so as to inhibit the growth of ovarian cancer cell lines.

RNAi;Ovarian cancer;TGF-β;Smads

R737.31

：A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.03.0330

2016－11－06

珠海市医疗卫生科技计划项目 （编号：20161027E030061）

刘继红 （1973－），女，河南籍，硕士学位，主治医师，研究方向：围产医学。