超声量化指标预测大鼠肝纤维化严重程度

桑亮，王学梅，许东阳，桑力轩，商功群，袁胜美，屠树星

（中国医科大学附属第一医院1.超声科；2.老年医学科，沈阳110001）

超声量化指标预测大鼠肝纤维化严重程度

桑亮1，王学梅1，许东阳1，桑力轩2，商功群1，袁胜美1，屠树星1

（中国医科大学附属第一医院1.超声科；2.老年医学科，沈阳110001）

目的利用四氯化碳（CCl4）复制大鼠肝纤维化模型，通过logistic回归探讨超声量化指标对肝纤维化严重程度的预测能力。方法40%CCl4复制大鼠肝纤维化模型，超声检测门静脉内径、血流速度及杨氏模量。大鼠肝组织HE染色，光镜下判定肝纤维化程度。结果门静脉内径、杨氏模量在肝纤维化严重程度判定中有统计学意义（P＜0.05），其中杨氏模量对肝纤维化严重程度判定预测能力最大，R2值为0.788。杨氏模量联合门静脉远段内径可以有效提高预测能力，R2值均为0.821。结论杨氏模量是单因素预测肝纤维化严重程度能力最大的指标，多指标联合能有效提高对肝纤维化严重程度的预测能力。

大鼠；肝纤维化；剪切波弹性成像；logistic回归

肝纤维化是肝内纤维组织的过度增生，是一系列肝病发展演变的中间阶段［1］，其严重程度的判定在肝病的诊疗中具有重要意义［2］。常规超声多以肝实质回声改变判定肝纤维化，受机器、人为因素影响，判定存在主观性，不能准确定量判定［3］。实时剪切波弹性成像技术（shear wave elastrography，SWE）检测肝脏杨氏模量为无创性判定肝纤维化程度提供了定量检测的新方法。本研究通过四氯化碳（CCl4）复制大鼠肝纤维化模型，以病理为金标准，利用logistic回归分析，判定门静脉内径、门静脉血流速度、SWE杨氏模量等量化指标对肝纤维化严重程度的预测能力。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠，雄性，健康，清洁级，体质量（200±20）g，购于辽宁长生生物技术有限公司。所有实验大鼠均分笼饲养，普通饲料喂养、自由进水。

1.2 方法

1.2.1 CCl4诱导大鼠肝纤维化模型的建立：于实验开始第0、2、4、6周分别购入大鼠15、15、10、10只，适应性饲养1周。造模采用橄榄油将CCl4配成40%的溶液，首次按1 mL/kg剂量经腹腔注射，以后每周2次按2 mL/kg剂量给药。于造模开始第8周末最后1次给药，禁食水24 h后行肝脏超声检查。

1.2.2 大鼠肝脏超声检查：

1.2.2.1 检查前准备大鼠称重并记录，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，电动剃发刀去除腹部体毛。

1.2.2.2 超声仪器应用法国声科Supersonic彩色超声诊断仪，配有实时SWE功能，选用线阵探头，探头频率4～15 MHz。

1.2.2.3 超声检测（1）门静脉内径，二维条件下清晰显示门静脉主干，冻结图像，测量距门静脉起始部约0.5～0.75 cm和1.5～2.0 cm处门静脉内径，分别标记为门静脉近段内径和门静脉远段内径，各测量3次，取平均值（图1A、1B）。（2）门静脉血流速度，二维条件下清晰显示门静脉主干，开启CDFI模式，血流信号显示稳定后打开PW模式，频谱稳定状态下冻结图像，测量门静脉血流速度，连续测量3次，取平均值（图1C）。（3）实时SWE检测肝组织杨氏模量，二维条件下清晰显示肝脏右叶或左叶，开启SWE模式，图像稳定后冻结图像，选取感兴趣区域测量弹性值，以kPa为单位。图像以感兴趣区域填充均匀一致的蓝色时为准。启动仪器提供的Q-BOX功能测量成像区域内的肝脏杨氏模量值，设定量程为180 kPa，Q-BOX区域直径为3 mm，测量3次并记录杨氏模量平均值（图1D）。

图1 超声量化指标Fig.1Quantitative ultrasound indexes

1.2.3 病理学检查：大鼠肝组织以10%甲醛固定48 h以上，石蜡包埋，间距4 μm连续切片，HE染色，显微镜下观察、采集图像。肝纤维化病理诊断由病理科专业医生参照《病毒性肝炎防治方案》［4］中的标准，根据汇管区及周围纤维化情况及小叶结构，将纤维化程度分为S0～S4期。

1.3 统计学分析

统计学分析以病理肝纤维化分期为依据进行分组，计量资料用x±s表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法LSD-t检验。肝纤维化严重程度的预测采用有序logistic回归分析。全部数据采用SPSS 16.0软件进行处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型的一般情况及病理改变

2.1.1 动物模型的一般情况：大鼠造模过程中死亡8只，随着造模周期延长出现进食差，色黄脱毛，运动迟缓，体质量增加缓慢。

2.1.2 动物模型大体标本及病理改变：S0期8只，S1期5只，S2期9只，S3期11只，S4期9只；造模10周以S4期为主，8周以S3期为主，6周以S2期为主，4周以S1期为主。造模4周大鼠肝脏被膜紧张，形态饱满，光镜下肝细胞存在点状、灶状坏死，小叶内局限性纤维化（图2A、2B）。造模8周大鼠肝脏表面不平、皱缩，可见结节改变，光镜下正常肝小叶结构破坏，假小叶清晰可见（图2C、2D）。

图2 大鼠造模4周和8周时大体标本及病理改变Fig.2Gross specimen and pathological changes in rats at week 4 and week 8

2.2 大鼠超声检查结果对照病理

2.2.1 大鼠门静脉近段内径及远段内径：门静脉近段内径与门静脉远段内径在出现肝纤维化后整体呈增宽趋势（近段内径S1期除外），但S1～S2期与S0期比较差异均无统计学意义（P＞0.05），S3～S4期与S0～S2期以及S4期与S3期比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2.2 大鼠门静脉血流速度：门静脉血流速度在S1期比S0期明显升高，随着肝纤维化加重呈下降趋势，到早期肝硬化（S4期）甚至低于S0期。其中S1期与S0期、S3～S4期与S1期比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同肝纤维化分期超声检查结果对照情况Tab.1Ultrasound results comparing different stages of liver fibrosis

2.2.3 大鼠肝脏SWE杨氏模量：SWE杨氏模量表现出随肝纤维化程度加重呈上升趋势，且S1～S4期与S0期比较以及S3～S4期与S1～S2期比较差异有统计学意义（P＜0.05），而S1期与S2期以及S3期与S4期比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 logistic回归分析预测肝纤维严重程度

根据以上结果，按照肝纤维化严重程度将实验大鼠重新分组，分为无肝纤维组（S0期）、轻度肝纤维化组（S1、S2期）、明显肝纤维化组（S3、S4期），进行单因素及多因素联合有序logistic回归分析，判断研究指标在肝纤维化病理改变严重程度中的预测能力。

2.3.1单因素有序logistic回归：本研究各个指标除门静脉血流速度外，在肝纤维化严重程度判定中均有统计学意义（P＜0.05），其中SWE杨氏模量对肝纤维化严重程度判定预测能力最大，R2值为0.788，回归方程分别为Y=15.615+1.576X和Y=23.799+ 1.576X。见表2。

表2 单因素有序logistic回归分析结果Tab.2Single factor ordinal logistic regression analysis

2.3.2 联合有序logistic回归：根据单因素有序logistic回归分析结果，联合SWE杨氏模量与门静脉内径进行有序logistic回归分析，R2值升高，但仅在SWE杨氏模量联合门静脉远段内径时有统计学意义（P＜0.05），R2为0.821，回归方程为Y=29.397+ 1.724X1+56.103X2，Y=39.143+1.724X1+56.103X2。见表3。

表3 多因素联合有序logistic回归分析结果Tab.3Multiple factor ordinal logistic regression analysis

3 讨论

肝组织活检对肝纤维化判定最为可靠，然而肝活检会对受检者产生创伤或潜在风险，严重时危及生命，较难作为随访和疗效观察的指标［5］。超声在肝脏疾病中应用最为普及，但无论敏感度还是特异度都差强人意［6］。当肝组织出现纤维化时其硬度可能已经增加，组织弹性下降，从而通过组织硬度变化反映肝纤维化程度［7］。SWE技术通过检测组织内剪切波的速度获得杨氏模量这一代表组织硬度的参数，反映组织硬度［8］。本研究结果显示，大鼠的肝脏杨氏模量值随肝纤维化程度的加重有增高趋势，与文献［9-10］报道的结果一致，说明SWE测得的肝弹性模量值能够反映肝组织硬度的变化。S1期与S2期以及S3期与S4期组间比较并无统计学差异（P＞0.05），提示SWE适用于肝纤维化严重程度的判断，但对肝纤维化分期的判定尚存在局限性。POYNARD等［11］的研究结果大致如此，这可能与肝纤维化病理连续变化有关。

本研究发现，随着肝纤维化的加重门静脉近段（除S1期）与远段内径均有增宽的趋势，但在轻中度肝纤维化时门静脉内径变化并不明显，对肝纤维化的提示意义不大，当发展到重度纤维化或早期肝硬化时，门静脉则出现较明显的增宽，可以起到很好的临床提示作用。既往研究［12］发现，随着肝纤维化程度的加重，慢性肝炎患者门静脉主干直径逐渐扩张。这可能由于肝组织纤维间隔收缩，肝内胆管周围纤维组织及胆汁不同程度的淤积加重肝小叶周围的机械压力，同时由于侧支循环建立，高压的肝动脉血流入低压的门静脉内会使门静脉压力增高所致。

肝组织损伤和修复理论上会导致肝脏微循环动力学变化。HIRATA等［13］的研究结果表明随着肝纤维化加重门静脉阻力提升，流速会不同程度下降，但BEMATIK等［14］通过研究不同程度肝病患者发现Doppler超声不能很好的提示严重性。本研究结果表明，在肝纤维化S1期门静脉血流速度比S0期明显升高，随着肝纤维化的加重呈下降趋势。Doppler超声对于判定肝纤维化存在较大差异，可能由于取样角度不同，加之不同作者对采样位置的选择也难以保证完全一致［15-16］。

目前研究证实很多指标与肝纤维化存在相关性，但针对肝纤维化严重程度预测的报道少见。本研究通过有序logistic回归分析发现，在超声量化指标中，实时SWE杨氏模量的R2值为0.778，对肝纤维化有很高的预测能力，可以作为单独指标进行肝纤维化判定，今后可以通过临床病例分析获得肝纤维化严重程度有效的诊断预测值。另外通过对研究指标进行多因素有序logistic回归分析，发现联合多项指标能提高肝纤维化严重程度的预测能力，本研究中实时SWE联合门静脉远段内径R2值为0.821，高于任何单一因素的预测能力。可以在今后的临床研究中通过回归分析建立简单有效的回归方程，准确的预测肝纤维化严重程度，指导临床治疗与预后的观察。但是研究存在一些不足之处：研究样本量少，可能导致不同肝纤维化分期间比较存在统计学误差；局限于实验研究，大鼠模型与临床对象肝纤维化病理改变存在差异，下一步应加入临床资料研究。

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（编辑 陈姜）

Prediction of the Severity of Liver Fibrosis in Rats Using Quantitative Ultrasound Index

SANG Liang1，WANG Xuemei1，XU Dongyang1，SANG Lixuan2，SHANG Gongqun1，YUAN Shengmei1，TU Shuxing1
（1.Department of Ultrasound，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Geriatrics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo assess the ability of quantitative ultrasound index to predict the severity of CCl4-induced liver fibrosis in a rat model using logistic regression analysis.MethodsIn a rat model of 40%CCl4-induced liver fibrosis，ultrasound detected the portal vein diameter，blood flow velocity，and Young’s modulus.The degree of hepatic fibrosis was determined using a light microscope after hematoxylin and eosin staining of tissue.ResultsPortal vein diameter and Young’s modulus were useful predictors of the severity of liver fibrosis，with statistical significance（P＜0.05）.Young’s modulus was most effective with anR2value 0.788.Young’s modulus combined with the distal diameter of portal vein effectively improved the predictive ability，showing anR2value 0.821.ConclusionYoung’s modulus is the most predictive index to assess the severity of liver fibrosis.A combination of multiple indices can improve the ability to predict the severity of liver fibrosis.

rat；liver fibrosis；shear wave elastrography；logistic regression

R445.1

A

0258-4646（2017）05-0429-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.012

辽宁省科学技术计划（2015020515）

桑亮（1983-），男，主治医师，博士.

王学梅，E-mail：wxmlmt@163.com

2016-10-10

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