白细胞介素17A在急性百草枯中毒小鼠肾损伤中的作用

宋宏伟，杨琛，刘伟，刘志

（中国医科大学附属第一医院急诊科，沈阳110001）

白细胞介素17A在急性百草枯中毒小鼠肾损伤中的作用

宋宏伟，杨琛，刘伟，刘志

（中国医科大学附属第一医院急诊科，沈阳110001）

目的探讨白细胞介素17A（IL-17A）在急性百草枯中毒小鼠肾损伤中的作用及其机制。方法72只ICR小鼠随机分为3组:生理盐水组（NS组）、百草枯中毒（PQ）组和抗体组（PQ+Ab组），每组24只。PQ与PQ+Ab组均采用一次性灌胃PQ溶液建立PQ中毒模型，PQ+Ab组于染毒2 h后一次性腹腔注射IL-17A抗体，NS组分别给予等量生理盐水。各组于染毒后8、24、48、72 h取6只小鼠处死，分别收集血清和肾组织样本，ELISA法检测血清IL-17A、血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）水平，化学比色法检测肾组织髓过氧化物酶（MPO）活性，肾组织经苏木素-伊红（HE）染色后观察组织形态变化并评分，免疫组化法和实时定量PCR法分别检测IL-17A蛋白及mRNA的表达。结果与NS组比较，PQ与PQ+Ab组小鼠血清中IL-17A水平升高，肾组织中MPO活性增加，血SCr、BUN升高（均P＜0.01）；与PQ组比较，PQ+Ab组小鼠血清中IL-17A显著降低、肾组织中MPO活性降低、血SCr、BUN水平下降（均P＜0.01），肾病理损伤减轻。结论IL-17A可能通过活化、募集中性粒细胞促进急性PQ中毒小鼠肾损伤，抗体阻断IL-17A能减轻该损伤。

白细胞介素17A；百草枯；中毒；肾损伤；小鼠

百草枯（paraquat，PQ）是一种杂环类除草剂，对人畜均有极强的毒性。有意或无意口服PQ溶液是中毒的主要途径，一旦中毒能引起多器官损伤。肾脏是PQ中毒后受累较早的器官，PQ中毒早期死亡患者多并发肾损伤。白细胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）是一种细胞因子，有研究［1］证实，IL-17A参与炎症性疾病导致的急性肾损伤（acute kidney injury，AKI），敲除IL-17A基因能保护脓毒症导致的AKI［2］，本研究通过建立急性PQ中毒小鼠模型，腹腔注射IL-17A抗体阻断IL-17A，探讨IL-17A在急性PQ中毒肾损伤中的作用及其可能途径。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂

8周龄健康雌性ICR小鼠（SPF级，26～30 g）购于辽宁长生生物技术有限公司［SCXK（辽）2015-0001］，建模实验前适应性喂养1周，小鼠自由活动、饮水、摄食，12 h光照/12 h黑暗处理。动物实验过程均符合伦理学。PQ溶液（浓度为25%，陕西加伦多有限公司），IL-17A、BUN、SCr ELISA试剂盒（北京博奥森有限公司），小鼠IL-17A中和性抗体（美国eBiosicence公司），IL-17A免疫组化试剂盒（英国Abcam公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司），mRNA引物（上海生工生物工程股份有限公司），其他试剂均由中国医科大学科学实验中心提供。

1.2 动物分组与干预

72只小鼠随机均分为3组：对照组（NS组）、中毒组（PQ组）、抗体组（PQ+Ab组），每组24只。NS组一次性灌胃等体积生理盐水，PQ和PQ+Ab组一次性灌胃PQ溶液（25 mg/kg），PQ+Ab组每只小鼠灌胃PQ溶液2 h后一次性腹腔注射IL-17A中和性抗体（5 mg/kg）。各组小鼠分别于染毒后8、24、48、72 h各取6只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后处死。血液样本经2 000 r/min离心后留取上层清液，保存于-20℃冰箱，待检；取左肾组织剪碎，加入适量生理盐水制成10%的组织匀浆，3 000 r/min，离心10 min，取上清液保存于-20℃冰箱，待检；取部分右肾组织固定于10%中性甲醛溶液，4℃冰箱保存，剩余部分保存于-80℃冰箱，待做PCR。

1.3 血清IL-17A、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCr）测定

采用酶联免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）法检测血清IL-17A、BUN、SCr水平，具体步骤按ELISA试剂盒说明书操作。

1.4 髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）检测

采用化学比色法检测肾组织匀浆上清液中MPO活性，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。在460 nm处读取吸光度值，MPO活性计算公式：MPO活性（U/g）=（A测定管-A对照管）/（11.3×取样量）。

1.5 肾组织病理学检测

肾组织常规脱水、石蜡包埋，用于制备石蜡切片。5 μm切片，HE染色后，光学显微镜下观察肾组织病理变化，Paller法［3］评估肾小管损伤程度：每张肾组织切片随机选择3个无重叠视野（×200），每个视野下随机选择3处肾小管，共9个肾小管计分，结果取平均值，分数越高表示肾小管损伤越严重。

1.6 免疫组化（immunohistochemistry，IHC）检测IL-17A表达

将固定好的肾组织经脱水、石蜡包埋和组织切片等步骤制作成5 μm的切片。IHC操作步骤严格按照IL-17A免疫组化试剂盒说明书进行。IHC切片在光学显微镜下观察。

1.7 实时定量PCR法检测肾组织IL-17A mRNA表达

肾组织匀浆，Trizol试剂提取总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，实时定量PCR扩增按照试剂盒说明书进行，反应体系按以下条件进行扩增：37℃逆转录15 min，85℃预变性2 min，85℃变性30 s，40℃退火延伸30 s，共40个循环。通过目的基因IL-17A与内参基因GAPDH比较测定IL-17AmRNA表达量。同时绘制溶解曲线，以保证PCR的效果。IL-17A与GAPDH序列由PubMed数据库查得，委托上海生工生物工程有限公司合成引物：IL-17A（344 bp），上游5’-TGTCAATGCGGAGGGAAAG-3’，下游5’-GCAGTTTGGGACCCCTTTAC-3’；GAPDH（183 bp），上游5’-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’，下游5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3’。

1.8 统计学分析

利用SPSS 22.0软件进行统计，计量资料以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Games-Howell法检验，双变量分析采用Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较

NS组小鼠未见明显异常。中毒小鼠可见躁动不安、倦怠、活动减少、行动迟缓、呼吸急促、口唇分泌物增多等表现。与PQ组相比，PQ+Ab组小鼠呼吸急促、口唇分泌物等表现较轻。

2.2 肾组织形态学观察及病理损伤评分

PQ组小鼠肾脏明显肿胀、变大，PQ+Ab组小鼠肾组织肿胀、变大程度较PQ组小鼠稍显轻微，见图1。肾组织HE染色镜下观察NS组小鼠每个观察时间点均无明显病理改变；PQ与PQ+Ab组可见肾小管上皮细胞水肿并逐渐加重，管腔逐渐狭窄甚至闭塞，部分肾小球逐渐增大至结构紊乱、间质充血、水肿，并有炎症细胞浸润；72 h时可见肾小管上皮细胞水肿减轻、管腔开放、间质充血水肿减轻、炎症细胞浸润减少，见图2。肾组织病理损伤评分结果显示，与NS组比较，PQ与PQ+Ab组明显升高，48 h时最高（均P＜0.01）；与PQ组比较，PQ+Ab组病理损伤评分较低（均P＜0.01），见表1。

2.3 各组小鼠血清IL-17A水平比较

NS组小鼠血清IL-17A各时间无明显变化。与NS组比较，PQ与PQ+Ab组血清中IL-17A明显升高，并在观察时间内持续升高（均P＜0.001）；与PQ组比较，PQ+Ab组各时间点血清IL-17A水平均下降（均P＜0.05），见表1。

图1 小鼠肾脏大体观察Fig.1General observation of mouse kidneys

图2 各组小鼠肾组织病理学所见Fig.2Histopathology of kidney tissue

表1 各组小鼠肾组织病理评分及血清IL-17A水平Tab.1Kidney tissue pathological score and serum IL-17A in mic

表1 各组小鼠肾组织病理评分及血清IL-17A水平Tab.1Kidney tissue pathological score and serum IL-17A in mic

1）P＜0.01 vs NS group；2）P＜0.01 vs PQ group；3）P＜0.001 vs NS group；4）P＜0.05 vs PQ group.

?

2.4 肾组织病理评分与肾血清中IL-17A的关系

结果显示，肾病理损伤程度与肾血清中IL-17A含量成正相关（r=0.671，P＜0.001）。

2.5 各组小鼠血清BUN、SCr水平比较

NS组小鼠血清BUN、SCr各时间无明显变化。与NS组比较，PQ与PQ+Ab组血清BUN、SCr水平明显升高，均在48 h时达高峰，差异有统计学意义（均P＜0.01）；与PQ组比较，PQ+Ab组小鼠血清BUN、SCr降低（均P＜0.01）。见表2。

2.6 各组小鼠肾组织MPO活性比较

表2 各组小鼠血清BUN、SCr水平Tab.2Levels of BUN and SCr of mice

表2 各组小鼠血清BUN、SCr水平Tab.2Levels of BUN and SCr of mice

1）P＜0.01 vs NS group；2）P＜0.01 vs PQ group.

?

NS组小鼠肾组织MPO活性各时间无明显变化；与NS组比较，PQ和PQ+Ab组小鼠肾组织MPO活性迅速升高（均P＜0.01）；与PQ组比较，PQ+Ab组MPO肾组织活性降低（均P＜0.01），见表3。

表3 小鼠肾组织MPO活性及IL-17A mRNA的表达Tab.3Activity of MPO and IL-17A mRNA expression in mouse kidneys

2.7免疫组化检测各组小鼠IL-17A表达比较

IL-17A主要存在于细胞胞质中，NS组的肾组织中未见表达IL-17A的细胞；PQ与PQ+Ab组小鼠肾组织中偶见表达IL-17A的细胞散在于肾小球和肾小管中，呈棕色；与NS组比较，3组间细胞表达未见明显差异。肾间质中可见IL-17A存在，见图3。

2.8 各组小鼠肾组织IL-17AmRNA表达比较

图3 免疫组化检测各组小鼠肾组织IL-17A表达DAB×200Fig.3Expression of IL-17A in mouse kidney tissue，assayed using IHC DAB×200

NS组小鼠肾组织中IL-17AmRNA极少量表达，与NS组比较，PQ组和PQ+Ab组小鼠肾组织IL-17A mRNA表达升高（P＜0.05）；与PQ组比较，PQ+Ab组降低（P＜0.05），见表3。

3 讨论

肾脏是人体主要的排泄器官，进入人体内的PQ主要经肾脏排泄，因此肾也是PQ中毒损伤的主要靶器官。本研究显示，PQ中毒后，小鼠血浆BUN、SCr的水平迅速显著升高。有研究［5］表明，PQ能引起以肾小管和间质损伤为主的AKI表现。实验观察到PQ中毒小鼠出现肾小管上皮细胞水肿、管腔逐渐狭窄甚至闭塞，部分肾小球增大、结构紊乱、炎症细胞浸润等肾损伤的病理改变；IL-17A抗体阻断后，上述病理改变减轻。

有关PQ中毒肾损伤的机制目前认为，一方面PQ在肾组织诱发脂质过氧化反应，引起细胞凋亡，凋亡细胞释放出炎症介质和细胞因子加重肾组织病理损伤［6-7］；另一方面，PQ中毒后，血清中升高的炎症介质也可参与肾损伤［8］，同时肾组织中炎性细胞因子的表达也升高［9］。IL-17A是一种促炎细胞因子，主要由辅助性17细胞（T helper 17 cell，Th17）分泌，少量由巨噬细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞分泌［10］，可参与炎症反应、自身免疫性疾病等，并在其中发挥重要作用［11］。本研究发现，PQ中毒后，血清中IL-17A水平显著升高；抗体阻断IL-17A后，伴随着血清中IL-17A含量降低，血清BUN、SCr浓度下降，肾组织病理损伤程度减轻。通过分析血清IL-17A的浓度与肾病理评分的关系发现血清中IL-17A含量越高，肾病理损伤越重。本研究结果表明，IL-17A促进急性PQ中毒后小鼠AKI。此外，通过IHC和PCR检测分析发现，PQ中毒后肾损伤的过程中，IL-17A在肾组织中极少表达，据此推测急性PQ中毒肾组织中参与肾损伤的IL-17A主要来自于外周循环。

既往研究［12］表明，IL-17A主要通过募集、活化中性粒细胞和单核巨噬细胞放大局部炎症反应加重组织损伤。MPO是由活化的中性粒细胞分泌的标志酶，具有杀灭病原体、损伤组织的作用［13］。MPO的活性可以反应局部组织中中性粒细胞的活化和聚集程度，其活性越高，则活化的中性粒细胞聚集越多，对组织的损伤也就越严重［14］。研究［15］证实，PQ中毒后，血中白细胞升高，中性粒细胞百分比增多。本实验PQ中毒后，小鼠肾组织中MPO活性显著升高，而阻断IL-17A后，肾组织中MPO活性降低。实验结果表明PQ中毒肾损伤的发生有中性粒细胞的参与，同时也说明，IL-17A可以通过活化、募集中性粒细胞参与PQ中毒后肾损伤。

本研究表明，小鼠PQ中毒后，IL-17A从外周血循环进入肾组织，并通过活化、募集中性粒细胞促进肾损伤，抗体阻断IL-17A能显著减轻PQ中毒小鼠的肾损伤，为抗体治疗急性PQ中毒提供了实验基础。

［1］CHAN AJ，ALIKHAN MA，ODOBASIC D，et al.Innate IL-17A-producing leukocytes promote acute kidney injury via inflammasome and Toll-like receptor activation［J］.Am J Pathol，2014，184（5）：1411-1418.DOI：10.1016/j.ajpath.2014.01.023.

［2］LUO CJ，LUO F，ZHANG L，et al.Knockout of interleukin-17A protects against sepsis-associated acute kidney injury［J］.Ann Intensive Care，2016，6（1）：56-65.DOI：10.1186/s13613-016-0157-1.

［3］PALLER MS，HOIDAL JR，FERRIS TF.Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat［J］.J Clin Invest，1984，74（4）：1156-1164.DOI：10.1172/JCI111524.

［4］KAEMMERER D，PETER L，LUPP A，et al.Comparing of IRS and-Her2 as immunehistochemical scoring schemes in gastroentero-pancreatic neuroendocrine tumors［J］.Int J Clin Exp Pathol，2012，5（3）：187-194.

［5］HONG GL，LIU JM，ZHAO GJ，et al.Cycloartenyl ferulate inhibits paraquat-induced apoptosis in HK-2 cells with the involvement of ABCC1［J］.J Cell Biochem，2016，117（4）：872-880.DOI：10.1002/jcb.25370.

［6］WEI T，TIAN W，LIU F，et al.Protective effects of exogenous β-hydroxybutyrate on paraquat toxicity in rat kidney［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，447（4）：666-671.DOI：10.1016/j. bbrc.2014.04.074.

［7］杨琛，马涛，刘志.急性百草枯中毒大鼠肾损伤的研究［J］.中华劳动卫生职业病杂志，2015，33（5）：370-374.DOI：10.3760/cma. j.issn.1001-9391.2015.05.016.

［8］焦路阳，宋志善，郭庆合，等.急性百草枯中毒大鼠肾损害时血清中炎性因子的变化［J］.中华劳动卫生职业病杂志，2011，29（3）：227-229.DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-9391.2011.03.020.

［9］TOMITA M，OKUYAMA T，HIDAKA K.Changes in mRNAs of inducible nitric oxide synthase and interleukin-1 beta in the liver，kidney and lung tissues of rats acutely exposed In paraquat［J］.Leg Med（Tokyo），1999，1（3）：127-134.

［10］LO RE S，DUMOUTIER L，COUILLIN I，et al.IL-17A-producing gamma-delta T and Th17 lymphocytes mediate lung inflammation but not fibrosis in experimental silicosis［J］.J Immunol，2010，184（11）：6367-6377.DOI：10.4049/jimmunol.0900459.

［11］NEMBRINI C，MARSLAND BJ，KOPF M.IL-17-producing T cells in lung immunity and inflammation［J］.J Allergy ClinImmunol，2009，123（5）：986-994.DOI：10.1016/j.jaci.2009.03.033.

［12］BRAUN RK，FERRICK C，NEUBAUER P，et al.IL-17 producing +δ T cells are required for a controlled inflammatory response after bleomycin-induced lung injury［J］.Inflammation，2008，31（3）：167-179.DOI：10.1007/s10753-008-9062-6.

［13］NIKULSHIN S，TOLSTIKOVA I，BARTULE A，et al.Intracellular neutrophil myeloperoxidase level in pediatric patients：significant age and gender variability［J］.Int J Lab Hematol，2015，37（1）：120-124.DOI：10.1111/ijlh.12252.

［14］SHARMA J，RASTOQI P，CREER MH，et al.Polymorphonuclear leukocytes isolated from umbilical cord blood as a useful research tool to study adherence to cell monolayers［J］.J Immunol Meth，2009，351（1/2）：30-35.DOI：10.1016/j.jim.2009.09.008.

［15］张翠萍，王胜武，李丽.白细胞及中性粒细胞对百草枯中毒患者预后的意义［J］.中国医药，2012，7（9）：1173-1175.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4777.2012.09.051.

（编辑 武玉欣）

Effects of Interleukin-17A on Acute Paraquat-intoxication-induced Kidney Injury in Mice

SONG Hongwei，YANG Chen，LIU Wei，LIU Zhi
（Department of Emergency，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effects of interleukin-17A on kidney injury induced by paraquat（PQ）.MethodsSeventy-two ICR mice were randomly divided into 3 groups:NS，PQ，and PQ+Ab（n=24 for each）.The PQ-poisoning model was established by administering a gavage of PQ solution；mice in the PQ+Ab group were then administereda dose of anti-IL-17A antibody 2 hours later by i.p.injection，whereas the NS group were administered a corresponding volume of normal saline instead.The mice were killed at 8，24，48，or 72 h to obtain renal tissues and serum.An enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to determine serum IL-17A，serum creatinine（SCr），and blood urea nitrogen（BUN）levels.Chemical colorimetry was used to detect the viability of myeloperoxidase（MPO）in renal tissue，and hematoxylin-eosin（HE）staining was used to observe the renal pathologic changes.Immunohistochemistry（IHC）and PCR were used to examine IL-17A expression in renal tissues.ResultsSerum IL-17A，renal tissue MPO viabilities，BUN，and SCr were increased in the PQ and PQ+Ab groups，compared to those in the NS group（P＜0.01）.However，the above-mentioned parameters were lower in the PQ+Ab group than in the PQ group（P＜0.01）.ConclusionIL-17A promotes mouse kidney injury induced by acute PQ-intoxication through activating and/or recruiting neutrophils；therefore，blockade IL-17A，with antibody can attenuate the injury.

interleukin-17A；paraquat；intoxication；kidney injury；mice

R594.4

A

0258-4646（2017）05-0392-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.003

国家自然科学基金（81571882）；辽宁省科学技术计划（2013225303）

宋宏伟（1989-），男，硕士研究生.

刘志，E-mail：Liuzhicmu@163.com

2016-10-13

网络出版时间：