CYP3A4、CYP3A5在肺腺癌中表达及其与预后的相关性

许菊青， 杨舒， 毛启星， 樊卫飞， 蒋峰

论 著

CYP3A4、CYP3A5在肺腺癌中表达及其与预后的相关性

许菊青， 杨舒， 毛启星， 樊卫飞， 蒋峰

目的 探讨CYP3A4、CYP3A5在肺腺癌组织中的表达水平及与预后的相关性。方法 收集南京医科大学附属肿瘤医院胸外科87例肺腺癌病理组织及其对应的临床资料，病理标本制作组织芯片，通过免疫组化法明确组织芯片中CYP3A4、CYP3A5蛋白的表达情况，结合临床病理特征和随访资料进行统计分析。结果 肺腺癌组织芯片的免疫组化结果显示，CYP3A4在肺腺癌组织中显著高表达，而其在癌旁正常组织中则显著低表达(P=0.012)；肺腺癌中CYP3A4的表达水平与肺腺癌TMN分期(P=0.013)和肿瘤分化程度(P=0.044)相关。与之相反，CYP3A5在肺腺癌组织中的表达水平显著低于癌旁正常组织(P<0.001)；肺腺癌中CYP3A5的表达与肺腺癌组织分化程度(P=0.013)显著相关。CYP3A4高表达患者总生存期和无瘤生存期较CYP3A4低表达患者显著缩短(P<0.05)，CYP3A5低表达患者总体生存期和无瘤生存期较CYP3A5高表达患者显著缩短(P<0.05)；联合分析显示，CYP3A4高表达合并CYP3A5低表达的患者预后较其他患者差(P<0.05)，COX多因素分析显示，CYP3A4高表达合并CYP3A5低表达为肺腺癌预后不良的独立危险因素。结论 CYP3A4高表达合并CYP3A5低表达是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素；CYP3A4高表达合并CYP3A5低表达可作为预测肺腺癌预后的一个新靶标。

CYP3A4； CYP3A5； 肺腺癌； 预后； 免疫组化

CYP3A4和CYP3A5是细胞色素P450酶系(cytochrome P450 enzyme system，CYPs)3A亚家族的主要成员。其传统的生物学功能是参与内外源性物质代谢。目前的研究热点主要集中在CYP3A4、CYP3A5多态性和肿瘤易感性，以及化疗药物代谢和肿瘤患者预后的关系方面。我们采用免疫组化法检测肺腺癌组织芯片CYP3A4和CYP3A5的表达，分析并探讨CYP3A4和CYP3A5与肺腺癌临床病理参数及预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 87例肺腺癌组织切片标本及相应癌旁组织切片标本都来自南京医科大学附属肿瘤医院胸外科，临床数据(包括患者性别、年龄、吸烟情况以及肿瘤分期、大小、分化程度、淋巴结转移)来源于该院病案室的病案记录。按照TNM分期标准：Ⅰ期34例，Ⅱ期24例，Ⅲ期29例。其中男性21例，女性66例。年龄30～78岁，平均年龄65.21岁。87例均具有随访记录，随访率100%。患者无瘤生存期(Disease-free survival, DFS)是从手术当天至疾病复发的时间，总生存期(Overall survival，OS)即手术当天至随访日(通过身份证信息或电话随访)。

1.2 组织芯片制作及免疫组化染色 87例肺腺癌组织标本均为10%甲醛固定，石蜡包埋，蜡块经筛选无明显缺陷。制作成组织芯片。免疫组织化学染色按En Vision二步法进行，具体步骤按说明书进行。CYP3A4单克隆抗体经Tris-EDTA缓冲液(pH=9.0) 沸水浴抗原修复，DAB显色，以试剂盒提供的阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照，在显微镜下结合常规HE染色片观察切片的显色反应。重复以上操作检测CYP3A5。

1.3 结果判定 分别观察CYP3A4、CYP3A5蛋白的分布、阳性强度和阳性率。免疫组化结果判断采用双盲法，由两位病理科医师对组织芯片上每个位点的染色结果进行评价。在高倍镜下(×400)分别对每个位点计数100个细胞，每例共计400个，按要求分别记录染色阳性细胞百分比及强度。若遇到各代表位点染色差异较大的情况，则另作该例标本的常规切片观察。免疫组化染色阳性信号为棕黄色或褐色，在高倍镜下观察，根据染色阳性肿瘤细胞数目所占百分比计分：阳性细胞数占0%为0分；1%～33%为1分；34%～66%为2分；67%～100%为3分。染色强度按肿瘤细胞着色的深浅计分：无着色为0分，黄色为弱阳性计1分，浅棕色为中等阳性计2分，棕褐色为强阳性计3分；根据染色强度和阳性细胞数计分之和进行判断：0～2分为低表达，3～6分为高表达。

1.4 实验数据处理及统计分析 应用SPSS 17.0软件分析。计量资料采用四格表χ2检验、Fisher确切概率法，生存分析用Kaplan-Meier法和Log-rank检验以及COX回归分析,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CYP3A4、CYP3A5在肺腺癌中的表达 87例肺腺癌组织切片标本行免疫组化染色后显示，CYP3A4、CYP3A5主要表达于细胞质，少数可同时表达于细胞核。CYP3A4在肺腺癌组织中显著高表达，其表达阳性率为73.6%(64/87)，而在癌旁正常组织中则显著低表达(P=0.012)；CYP3A5在肺腺癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织(P<0.001)，CYP3A5在肺腺癌组织中呈弱阳性表达，其表达阳性率为49.4%(43/87)(图1～2)。

2.2 CYP3A4、CYP3A5的表达与临床病理参数及预后的关系 CYP3A4在肺腺癌中的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、胸膜侵犯无关，而与TMN分期(P=0.013)和分化程度(P=0.044)相关。CYP3A5在肺腺癌中的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、TMN分期和胸膜侵犯无关，而与分化程度(P=0.013)显著相关(表1)。

图1 肺腺癌组织及癌旁正常组织CYP3A4表达(×400)

图2 肺腺癌组织及癌旁正常组织CYP3A5表达(×400)

表1 CYP3A4、CYP3A5表达与肺腺癌临床病理特征的关系

*：不同表达水平比较，P<0.05

2.3 预后分析Kaplan-Meier生存分析显示，CYP3A4高表达患者总体生存期(P=0.002)和无瘤生存期(P=0.002)较CYP3A4低表达患者显著缩短， CYP3A5低表达患者总体生存期(P=0.006)和无瘤生存期(P=0.007)较CYP3A5高表达患者显著缩短。联合分析显示，CYP3A4低表达合并CYP3A5高表达与CYP3A4低表达合并CYP3A5低表达患者预后较好，这两组患者间的生存期没有明显差异；CYP3A4高表达合并CYP3A5低表达与CYP3A4高表达合并CYP3A5高表达总体生存期和无瘤生存期明显缩短，其中CYP3A4高表达合并CYP3A5低表达的患者总生存期(P=0.036)和无瘤生存期(P=0.036)最短，预后最差。再进一步分析发现，CYP3A4高表达合并CYP3A5低表达是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素。

3 讨论

CYP3A4和CYP3A5是细胞色素酶P450 CYP3A亚家族的2个主要成员，其含量丰富，底物覆盖广泛，两者催化50%以上临床常用药物的氧化还原反应[1]，包括抗雌激素药物他莫昔芬，抗癌药物环磷酰胺、多西他赛、长春碱类，以及靶向药物索拉菲尼、舒尼替尼等，是药物代谢反应中最主要的限速酶。CYP3A还参与了多种前致癌物质和致突变物的活化代谢过程，并与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关。

CYP3A4主要分布在肝脏和小肠，是成人肝脏表达的主要CYP蛋白，CYP3A5主要分布于一些肝外组织如肠壁、肾、前列腺和肺等。CYP3A4和CYP3A5的表达及活性有着很大的个体间、种族间差异，这主要由CYP3A单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)决定。

CYP3A4/CYP3A5在肺癌中的作用尚不明确，研究结果也不尽相同。一组涵盖了801例患者的病例对照研究显示携带CYP3A4*1B基因型可明显增加小细胞肺癌的发生风险[2]。另有研究发现CYP3A5*3纯合子基因型使肺癌的发生风险增加了4.3倍，并且CYP3A4*1B和CYP3A5*3多态性决定了在化疗药物疗效及毒性方面存在个体差异性，两者在指导肺癌个体化治疗及药物代谢方面起重要作用[3]。但是，通过检索pubmed数据库，截至2016年9月，未见有CYP3A4、CYP3A5对肺癌恶性生物学行为及预后的影响方面的报道。

本研究结果显示，CYP3A4在肺腺癌中显著高表达，且肿瘤分期越晚、分化程度越低其表达越高。CYP3A4低表达组患者总体生存期和无瘤生存期较CYP3A4高表达组患者明显延长，提示CYP3A4高表达可能在促进肺腺癌侵袭转移方面发挥重要作用，从而导致较差的预后。Mitra等[4]通过体外实验发现CYP3A4促进激素受体阳性乳腺癌细胞恶性增殖的信号通路，CYP3A4促进(±)-14，15-EET(环氧二十碳三烯酸)生物合成，抑制了激活因子3(STAT-3)磷酸化作用和核转运，从而导致恶性细胞的无限增殖。另一项研究发现，CYP3A4具有促进肝癌细胞增殖的“癌基因”生物学功能，机制可能是CYP3A4可通过造成肝癌细胞低氧环境来诱导低氧反应元件(HRE)启动子活性的增强，促进促红细胞生成素(EPO)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达含量的增加，继而诱导磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的活化，PI3K/Akt参与调节肿瘤细胞的增殖迁移[5]。

本研究结果还显示CYP3A5在癌旁正常肺组织的表达明显高于肿瘤组织，这与Anttila等[6]的研究结果一致。癌组织中CYP3A5高表达组患者总体生存期和无瘤生存期较低表达组患者明显延长，提示CYP3A5可能在肿瘤侵袭转移过程涉及细胞-细胞间及细胞-基质间的相互作用中发挥抑癌作用。研究表明，CYP3A5活性酶能催化6β-羟基睾酮，诱导睾酮失活，从而抑制激素依赖性的前列腺细胞的恶性增殖[7]。Jiang Feng团队[8]发现CYP3A5可作为一个保护性因子抑制肝细胞肝癌的侵袭转移，其抑制肝癌细胞侵袭转移的分子机制是CYP3A5通过细胞内ROS单纯抑制mTORC2激酶活性，进而选择性抑制AKT(S473)活化，引起AKT信号通路下调，从而抑制肝细胞肝癌侵袭转移。

进一步分析，我们发现高表达CYP3A4合并低表达CYP3A5的肺腺癌患者预后最差，是影响患者预后的独立因素。因此认为，高表达CYP3A4和低表达CYP3A5可能可以作为预测肺癌预后的新靶标，为肺癌的个体化治疗提供理论依据。

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Relationship between the expressions of CYP3A4, CYP3A5 and prognosis in lung adenocarcinoma

XUJuqing1,2,YANGShu2,MAOQixing1，FANWeifei2,JIANGFeng3.

(1.TheFourthSchoolofClinicalMedicine,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China; 2.DepartmentofOncology,JiangsuProvinceGeriatricHospital,Nanjing210024,China; 3.DepartmentofThoracicSurgery,NanjingMedicalUniversityaffiliatedCancerHospital,Nanjing210009,China)

Correspondingauthor：JIANGFeng,Email：jiangfeng174@sohu.com

Objective To investigate the expression of CYP3A4 and CYP3A5 in lung adenocarcinoma and its correlation with prognosis. Methods The clinical features of 87 lung adenocarcinoma patients were collected. Subsequently, immunohistochemical (IHC) analysis was performed to detect CYP3A4 and CYP3A5 expressions in 87 lung adenocarcinoma cases on a tissue microarray sample. Finally, the relationship between CYP3A4 and CYP3A5 expression as well as the clinic pathological characteristics of NSCLC were analyzed statistically. Results Our study showed that the expression of CYP3A4 was significantly higher in lung adenocarcinoma than that in normal tumor-adjacent tissues (P=0.012). CYP3A4 protein expression in lung adenocarcinoma was related to TNM stage (P=0.013) and differentiation (P=0.044). Expression of CYP3A5 was lower in lung adenocarcinoma than that in normal-adjacent tissues (P<0.05). Significance was observed between CYP3A5 expression and differentiation (P=0.013). The Kaplan-Meier method suggested that high CYP3A4 and low CYP3A5 expressions were significantly associated with short disease-free survival and overall survival of patients. Conclusions This study provides evidence that the high CYP3A4 and low CYP3A5 expression level was an independent risk factor of lung adenocarcinoma and could act as a new target for prognosis of lung adenocarcinoma.

CYP3A4; CYP3A5; Lung adenocarcinoma; Prognosis; Immunohistochemical

210029 江苏 南京，南京医科大学第四临床医学院(许菊青，毛启星)； 210024 江苏 南京，江苏省老年医院肿瘤科(许菊青，杨舒，樊卫飞)； 210009 江苏 南京，南京医科大学附属肿瘤医院 胸外科(蒋峰)

蒋峰，Email：jiangfeng174@sohu.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.01.006

1674-4136(2017)01-0021-04

2016-10-27][本文编辑：李筱蕾]