Hedgehog信号通路中Shh与PCNA蛋白在鼻咽癌中的表达及临床意义

姚利， 聂国辉， 蔡智， 陆兴， 刘凤安

论 著

Hedgehog信号通路中Shh与PCNA蛋白在鼻咽癌中的表达及临床意义

姚利， 聂国辉， 蔡智， 陆兴， 刘凤安

目的 研究鼻咽癌(carcinomaofnasopharynx，NPC)组织中Shh蛋白的表达以及与增殖细胞核抗原(PCNA)表达的关系。方法 应用免疫组化Elivision PIus二步法，检测2009年3月至2014年1月北京大学深圳医院收治的50例鼻咽癌和26例炎性鼻咽部黏膜组织中Shh和PCNA蛋白的表达。结果 Shh和PCNA在鼻咽癌组织中的阳性表达率均较鼻咽慢性炎症组织阳性表达率增高(均P<0.05)。鼻咽癌组织中Shh蛋白表达率与鼻咽癌临床T分期，颈淋巴结转移有关(P<0.05)；PCNA的表达与鼻咽癌颈部淋巴结转移有关(P<0.05)，但与其临床分期无关(P>0.05)。Shh表达与PCNA表达呈正相关。结论 Shh蛋白表达与肿瘤的高增殖活性有关，检测鼻咽癌组织中Shh及PCNA的表达有利于判断鼻咽癌原发病灶浸润生长程度和转移的风险，可为判断鼻咽癌预后提供参考。

鼻咽癌； Shh蛋白； PCNA蛋白； 预后； 肿瘤标记物

近年来，人们发现肿瘤细胞和正常细胞生长有相似之处，一些在胚胎发育、细胞分化过程中起重要调控作用的Shh信号传导通路在肿瘤的发生、发展中也起着重要作用[1]。研究表明，在多种恶性肿瘤中均发现Shh通路的异常激活[2-3]。肿瘤细胞过度表达Shh并以旁分泌方式激活邻近细胞的信号通路，Shh信号通路在间质微环境中的活化可促进肿瘤生长，但在鼻咽癌中其是否存在Shh通道的异常激活，他与癌细胞的增殖活性标志物增殖细胞核抗原(PCNA)是否有关尚不清楚。本研究拟通过免疫组织化学方法检测hedgehog信号通路中Shh蛋白及PCNA在鼻咽癌的表达情况，以探讨他们与鼻咽癌组织侵袭、转移的关系，为评估预后提供新的临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2009年3月至2014年1月北京大学深圳医院鼻咽癌患者的病理石蜡包埋标本50例，为鼻咽癌(carcinoma of nasopharynx，NPC)组。男38例，女12例；年龄20～71岁，平均年龄40岁；均为鼻咽非角化性癌，病理组织经HE切片再次复检确诊；T1期10例，T2期21例，T3期14例，T4期5例；颈淋巴结转移30例，无转移20例；患者均未接受过放射治疗及化学药物治疗。对照组为同期活检的慢性鼻咽黏膜炎性组织标本26例，其中男16例，女10例；年龄19～68岁，平均年龄42岁。

1.2 免疫组化法 兔抗人多克隆抗体Shh购自美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶100。鼠抗人PCNA单克隆抗体、PCNA工作浓度为1∶50。Elivision Plus试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。所有的石蜡组织标本连续切片，每张厚约5 μm。采用免疫组化Elivision Plus二步法，免疫组化染色程序按试剂盒说明书进行。采用已知阳性的肺癌组织作为阳性对照，用PBS代替一抗和二抗作阴性对照。

1.3 结果判断 由两位病理科医生采用双盲法进行判定，Shh阳性表达主要在细胞质，呈棕黄色，阳性颗粒粗细不等。PCNA主要表达于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒样分布。显微镜下观察，肿瘤细胞未着色或着色<10%为阴性(-)，肿瘤细胞着色11%～25%为阳性(+)，26%～50%(++)，>51%(+++)，结果用百分率表示。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计数资料组间比较采用χ2检验，蛋白表达相关性采用Spearman等级相关分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Shh及PCNA蛋白在鼻咽组织中的表达 本组Shh蛋白在慢性炎性鼻咽黏膜组织中仅少数呈(+)表达，阳性表达率为19.2%；在癌组织中呈(++～+++)表达，其阳性表达率为58.0%。Shh蛋白在伴颈淋巴结转移的肿瘤细胞胞膜及胞质中呈巢状分布，肿瘤间质细胞无染色，在不伴淋巴结转移的肿瘤细胞胞膜及胞质中呈散在分布，且随着肿瘤临床分期的增加，表达亦有增强的趋势，见图1～3。

PCNA阳性细胞核呈棕褐色细颗粒状，范围与细胞核等大，故核形状清晰可见，细胞质无染色。PCNA在慢性炎性鼻咽黏膜组织中仅少数呈(+)表达，阳性表达率为34.6%，在癌组织中呈(++～+++)表达，阳性表达率为76.0%。PCNA蛋白在伴淋巴结转移的肿瘤细胞核中呈(+++)表达，且癌旁组织多为(+)表达，在不伴淋巴结转移的肿瘤细胞核中呈(+～++)表达，见图4～6。

Shh及PCNA蛋白在NPC和鼻咽炎性患者中的表达情况见表1，Shh蛋白及PCNA在NPC患者中表达均高于慢性鼻咽炎患者，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表1 Shh和PCNA的表达在NPC和鼻咽炎性组织中的比较(例)

2.2 NPC中Shh和PCNA的分布与NPC临床T分期及淋巴结转移的关系 如表2、表3所示，Shh的表达与NPC的临床T分期、淋巴结转移有关(P<0.05)；PCNA的表达与NPC临床T分期无关(P>0.05)，但与淋巴结转移有关(P<0.05)。

表2 Shh和PCNA表达在NPC不同临床T分期中的比较(例)

表3 Shh和PCNA的表达在有无淋巴结转移的NPC中的比较(例)

2.3 NPC中Shh及PCNA表达相关性Spearman等级相关分析显示，Shh蛋白与PCNA蛋白表达呈正相关(P<0.01)，见表4。

表4 NPC中Shh表达与PCNA表达的关系

3 讨论

Nüsslein-Volhard等[4]于二十世纪八十年代首次在果蝇中发现了hedgehog(HH)基因，认为在人体胚胎发育中具有调节细胞增殖与分化的作用。而在人类基因组中，HH基因具有3个同源基因：Sonichedgehog(Shh)，Deserthedgehog(Dhh)和Indianhedgehog(Ihh)，分别编码Shh，Dhh，Ihh蛋白。其中Shh研究最为广泛，位于7号染色体长臂的3区6带(7q36)，编码一种与早期胚胎发育密切相关的Shh分泌蛋白，在人体多种组织细胞中都有分布。新近的研究表明[5]，Shh蛋白参与了基因的转录，细胞因子以及某些功能蛋白的表达，器官的正常构建，肿瘤的发生等一系列事件。在Shh信号通路激活异常后，可引起许多组织器官肿瘤的形成。

本研究发现，炎性鼻咽黏膜组织的Shh多为阴性表达，仅5例呈弱阳性，而NPC组织的Shh表达呈(++～+++)，表达阳性率58.0%，高于炎性组织的19.2%，P<0.05。提示在炎性鼻咽组织中可能也有Shh信号通路的存在，但此通路处于静止状态，而NPC组织中可能存在着此信号通路的过度激活。刘森林等[6]在对68例胃癌组织标本研究中也发现Shh阳性表达45例，阳性表达率为66.8%，Shh的阳性表达与癌组织浸润的深度、淋巴结转移情况、TNM分期等密切相关。这与其他一些学者[7-9]的研究相似，认为Shh蛋白在干细胞的分裂、分化、死亡等过程中起着重要作用，并影响正常黏膜上皮细胞的分化，使其停止在不同的肿瘤分期。本研究也显示NPC中Shh表达在T3～T4期高于T1～T2期，有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者(均P<0.05)，提示Shh为NPC上调的表达蛋白，在NPC的发展过程中，肿瘤细胞分泌Shh蛋白越多，其浸润和转移能力越强，其表达升高可能通过激活某种机制而参与了NPC的发生。另外本研究中Shh蛋白表达位于癌巢肿瘤细胞着色尤为明显，这也提示具有转移潜能的癌细胞多位于癌巢的周边，有利于肿瘤细胞脱离原灶向远处转移。

增殖细胞核抗原PCNA蛋白是一种相对分子质量为36KD的酸性蛋白质，是DNA聚合酶的辅助蛋白，对调节DNA的合成和增殖有重要的作用，仅出现在增殖状态细胞核内，其表达在G1期开始增强，逐渐增加到S期达到高峰，G2、M期明显下降，在G0无明显表达[10]。PCNA表达量的变化与DNA合成一致，可作为细胞增殖状态的一项检测指标[11]。PCNA在肿瘤组织高表达者表明癌组织处于高度增殖状态，肿瘤生长速度快，局部浸润和淋巴结转移的可能性大，提示PCNA与肿瘤浸润深度、TNM分期及淋巴转移相关[12-14]。本研究发现，PCNA在NPC组织中的阳性表达率为76.0%，在伴有颈淋巴结转移的NPC组织中的阳性表达率高达93.3%，提示PCNA的表达升高有可能参与了NPC细胞的恶性转化和淋巴结转移。但本实验中PCNA表达强度与肿瘤侵袭范围及分期无关，这可能与选择的标本例数偏少，以及检测方法不同有关。推测PCNA是反映NPC增殖活动的重要指标之一，检测PCNA的表达可以作为预测鼻咽癌预后的有用指标，与其他相关因子联合检测可能更有利于评估鼻咽癌的预后。

胡伟国等[15]研究认为Shh信号途径与干细胞的自我更新和增殖密切相关一致。孙炯等[12]研究中发现，Shh通过控制细胞周期蛋白D和p21来促进细胞增殖，通过作用于3-磷酸肌醇激酶、Bc1-2而抑制上皮细胞凋亡，促进肿瘤的高增殖活性。本研究发现，Shh表达与PCNA表达呈正相关(r=0.426，P<0.05)，提示Shh蛋白表达可能与肿瘤细胞的增殖相关。结合相关研究，初步推测，在组织细胞的损伤修复过程中，Shh信号通路呈一过性激活，促进上皮细胞中的干细胞自我更新，但长期慢性刺激使Shh信号持续活化，使肿瘤细胞的PCNA阳性表达率显著增高，诱导诱导细胞的无序增殖而诱发恶变。

综上所述，检测NPC组织中的Shh及PCNA表达有利于判断NPC原发病灶浸润生长程度和转移的风险，能为评估NPC的预后提供参考。

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Expression of Shh protein and PCNA protein in hedgehog signal transduction pathway in nasopharyngeal carcinoma

YAOLi,NIEGuohui,CAIZhi,LUXing,LIUFeng’an.

(DepartmentofOtolaryngology,PekingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036，China)

Correspondenceauthor:LUXing,Email:Luxing006@126.com

Objective To study the expression of Shh protein and proliferating cell nuclearantigen(PCNA) in nasopharyngeal carcinoma. Methods Immunohistochemical Elivision PIus two-step method, to detect the expression of Shh and PCNA protein in 50 cases of nasopharyngeal carcinoma and 26 cases of inflammatory nasopharyngeal mucosa during March 2009 to January 2014,at the Peking University Shenzhen hospital. Results Shh and PCNA in nasopharyngeal carcinoma (NPC) were compared with nasopharyngeal tissue of chronic inflammation showed higher expression(P<0.05).In the NPC tissues between Shh expression and the degree of cervical lymph node metastasis is significantly correlated (P<0.05)；Shh protein expression and NPC clinical staging has close relationship(P<0.05). The expression of PCNA in NPC and cervical lymph node metastasis is correlated ,but not correlated with the clinical stage. Shh high expression of the case group PCNA positive rate is also high； and Shh low expression of the case group PCNA positive rate is low, the two expression is positively correlated. Conclusions Theexpression of Shh protein was related to the high proliferative activity of the tumour, Shh and PCNA detection in nasopharyngeal carcinoma (NPC), help to judge nasopharyngeal carcinoma primary lesion growth degree of infiltration, and the transfer of risk, provide a reference for judging the prognosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC).

Nasopharyngeal carcinoma； Shh； PCNA； Prognosis； Tumor marker

广东省深圳市科技计划项目(201302072)

518036 广东 深圳， 北京大学深圳医院 耳鼻咽喉科

陆兴，Email：Luxing006@126.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.01.005

1674-4136(2017)01-0017-04

2016-05-01][本文编辑：李庆]