Neu-P11通过抑制氧化应激降低急性高眼压大鼠眼内压

石金凤，张星慧，李美香，佘美华，贺鹏程，田期先，Moshe Laudon，尹卫东,，张 瑶

(1.南华大学心血管疾病研究所，2.南华大学药学与生物科学学院生物技术系，3.衡阳爱尔眼科医院，湖南 衡阳 421001；4.常德市第一人民医院，湖南 常德 415000；5.Neurim Pharmaceuticals Ltd，以色列)

Neu-P11通过抑制氧化应激降低急性高眼压大鼠眼内压

石金凤1，张星慧3，李美香1，佘美华2，贺鹏程2，田期先1，Moshe Laudon5，尹卫东1,2，张 瑶4

(1.南华大学心血管疾病研究所，2.南华大学药学与生物科学学院生物技术系，3.衡阳爱尔眼科医院，湖南 衡阳 421001；4.常德市第一人民医院，湖南 常德 415000；5.Neurim Pharmaceuticals Ltd，以色列)

目的 褪黑素(melatonin, Mel)是由松果体分泌的一类吲哚类神经内分泌激素，具有调节昼夜节律和抗氧化等广泛的生物学作用。新型褪黑素非选择性受体激动剂Neu-P11与褪黑素作用相似。该文旨在研究Neu-P11对急性高眼压大鼠眼内压的影响及其相关机制。方法 采用Trendelenburg卧位(头低脚高80°位置)法将30只健康8周龄SD大鼠建立急性高眼压模型，即动物被置于Trendelenburg卧位，用Tonopen XL接触眼压计每5 min测量1次眼内压，取20 min最大值。建模后将大鼠随机分为5组：正常眼压+生理盐水组、高眼压+生理盐水组、高眼压+10 mg·kg-1Mel组、高眼压+20 mg·kg-1Neu-P11组、高眼压+50 mg·kg-1Neu-P11组，每组6只。给药后平位休息2 h，再次置于Trendelenburg卧位45 min后，连续监测6 h眼内压(每小时1次)。连续给药1周后，注射过量戊巴比妥钠处死SD大鼠，心脏取血，检测急性高眼压大鼠血清中MDA、SOD和GSH-Px的活性；留取各组大鼠眼球进行常规组织学切片，观察SD大鼠视网膜形态学变化。结果 Trendelenburg卧位诱导模型组大鼠眼内压值比正常组升高了约202.9%(P<0.01)，且视网膜增厚，层次不清，机体氧化应激水平明显升高。而经Neu-P11和褪黑素治疗后，明显改善了机体氧化应激水平和视网膜水肿，降低大鼠眼内压。结论 Neu-P11可能通过抑制机体氧化应激水平，降低急性高眼压大鼠眼内压。

Neu-P11；褪黑素；眼内压；特伦德伦伯卧位；MDA；SOD；GSH-Px

目前认为，眼内压(intraocular pressure, IOP)升高是引起青光眼的最主要原因和可变的危险因素，降低IOP是治疗青光眼的有效途径[1]。氧化应激与眼内压升高密切相关，在高眼压状态下，自由基的产生与消除失衡导致活性氧在视网膜细胞内蓄积而引发的细胞毒性，导致视网膜细胞受损[2]。吲哚类神经内分泌激素褪黑素(melatonin, Mel)，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等广泛的生物学作用[3]，可以作为黄斑变性和青光眼的一种辅助治疗药物[4]。然而，褪黑素存在药物合成提取相当困难复杂、半衰期短和个体差异大等不足。因此，科学家们不断地寻找有效的替代新药。以色列研制出的新型褪黑素非选择性受体激动剂——Neu-P11是能够克服以上缺陷的一种新药。我们前期研究表明，Neu-P11具有抗抑郁、抗氧化、降低正常新西兰兔的眼内压等作用[5-8]，但Neu-P11是否能降低高眼压动物的眼内压及其相关机制，目前尚未明确。

1 材料与方法

1.1 动物与材料 选取30只健康8周龄SD大鼠[购自南华大学动物部，体质量(220±25)g]，每3只大鼠为1笼，被喂以普通饲料，自由饮水与进食。正式实验前，常规适应环境饲养1周(通风，温度18℃～25℃，湿度40%，光照与黑暗时间各12 h)。Neu-P11由Neurim Pharmaceuticals Ltd公司提供；GSH-Px、SOD、MDA测试盒购自南京建成；Tonopen XL接触式眼压计购自美国Reichert公司。

1.2 模型建立与分组 将30只SD大鼠分为正常对照组(NIS)(n=6)和模型组(n=24)。采用Trendelenburg卧位(头低脚高80°位置)法建模[9]。即每天上午固定时间(8 ∶00～9 ∶00 am)，动物被置于Trendelenburg卧位并监测眼压，测量20 min内眼压值，每5 min测1次，共4次，取最大眼内压值。模型组分为正常对照组、高眼压对照组(HIS)、Mel(10 mg·kg-1)治疗组(HIS-M)、Neu-P11(20 mg·kg-1)处理组(HIS-N)、Neu-P11(50 mg·kg-1)处理组(HIS-NH)，每组6只，通过腹腔注射固定体积(1 mL)药物进行治疗。给药后水平位置休息2 h，再次放置于Trendelenburg卧位45 min，置于平面，采用Tonopen XL接触眼压计测量大鼠眼内压值，每小时测1次，连续监测6 h，重复实验1周。

1.3 MDA含量、GSH-Px和SOD酶活性的测定 注射过量戊巴比妥钠处死SD大鼠，心脏取血于离心管中，3 000 r·min-1高速离心5 min，收集血清并分装储存于-20℃冰箱。MDA含量、GSH-Px和SOD酶活性的测定分别用相应测试盒检测，7 d内完成检测。

1.4 视网膜组织形态学检查 过量戊巴比妥钠麻醉处死SD大鼠后，迅速摘除大鼠眼球并标记，立即放入眼科固定液(Carrnov25改良液)中固定24～36 h，期间换液5次。脱水5 h后“开窗”，显微镜下自9 ∶00～3 ∶00水平面剖开。二甲苯透明30 min，期间换1次。石蜡包埋后，制作厚5 μm切片，裱于用多聚赖氨酸处理的载玻片上，烤干进行HE染色。

2 结果

2.1 Trendelenburg卧位对SD大鼠眼内压的影响 采用Trendelenburg卧位法建立急性高眼压大鼠模型。结果如Fig 1所示，经Trendelenburg卧位诱导后，模型组SD大鼠的眼压值升高约为Normal组3倍以上(P<0.01)，差异有显著性，即急性高眼压大鼠模型建立成功。

Fig 1 Effect of Trendelenburg position on IOP in SD rats

**P<0.01vsnormal group

2.2 Neu-P11对急性高眼压大鼠眼内压的影响 如Fig 2所示，与高眼压对照组相比，HIS-M和HIS-N/NH组都能明显降低眼内压(P<0.05)，且HIS-N组的降压效果优于高浓度HIS-NH处理组。结果提示Neu-P11腹腔注射给药治疗具有降低高眼压大鼠眼内压的效果，且适当浓度(如20 mg·kg-1)的治疗效果更佳。

Fig 2 Effects of intraperitoneal administration of Neu-P11 or melatonin on IOP in SD rats

*P<0.05,**P<0.01vsHIS group

2.3 Neu-P11对急性高眼压大鼠视网膜组织形态学的影响 HE染色结果如Fig 3所示，正常组大鼠视网膜形态结构正常，分层清晰，各层细胞均排列整齐，边界也十分清楚。高眼压大鼠眼压升高过程中视网膜的厚度发生了变化，高眼压组大鼠视网膜明显增厚水肿，胞质空亮，层次清晰度欠佳，内层视网膜细胞间隙增大变厚。经药物Neu-P11/Mel治疗后，各组视网膜均不同程度地变薄，细胞排列较整齐，各层分界较清晰，而HIS-NH组相较于其他组而言，改善效果不明显。

Fig 3 Histopathological examination in retina of rats by HE staining(×400)

A：NIS；B：HIS；C：HIS-M；D：HIS-N；E：HIS-NH

2.4 Trendelenburg卧位对大鼠血清中MDA含量、SOD和GSH-Px酶活性的影响 为了研究Trendelenburg卧位对大鼠体内氧化应激水平的影响，我们检测了大鼠血清氧化应激相关指标的水平。结果如Fig 4所示，HIS组大鼠血清氧化应激参数与正常组相比，出现明显异常，高眼压模型组血清中MDA含量明显升高(Fig 4A)，而相关抗氧化酶活性(SOD、GSH-Px)明显降低(P<0.01)(Fig 4B、4C)。经Neu-P11/Mel治疗后，与HIS组相比，MDA含量明显下降，逆转了抗氧化酶的活性，SOD和GSH-Px酶活性明显提升(P<0.01)，各项指标接近正常值，且HIS-N比HIS-NH组提高抗氧化酶GSH-Px活性和降低脂质过氧化物MDA的含量的作用更强，对SOD酶活性作用相似，提示适量浓度Neu-P11(20 mg·kg-1)比高浓度Neu-P11(50 mg·kg-1)有更好改善机体氧化应激水平的作用。即Neu-P11/Mel治疗均能改善机体氧化应激水平。

3 讨论

眼内压增加与青光眼的发展密切相关，大量实验表明降低眼内压是治疗青光眼的重要措施[10]。在青光眼的发生发展中，氧化损伤占有重要作用。氧化自由基和活性氧族通过影响人小梁网细胞的结构和功能，使房水的流出受阻，引起眼内压增高[11]。眼组织缺血缺氧会造成包括青光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞等疾病[12]。

褪黑素是一类具有调节昼夜节律和强效抗氧化作用的吲哚类神经激素，具有降低眼内压的作用[9]。褪黑素受体主要集中在视网膜上的光感受器和神经节细胞内，具有保护光感受器和改善由高眼压引起的视网膜功能损伤的作用。褪黑素受体激动剂Neu-P11与褪黑素有类似功能，具有抗炎和抗氧化等作用[5-8]。席守民等[13]研究表明，Neu-P11能够降低正常状态下兔的眼内压，而其是否能降低高眼压状态下眼内压目前尚不明确。因此，本实验旨在研究Neu-P11对急性高眼压大鼠眼内压的影响及其相关机制，这对青光眼类眼科疾病的防治具有十分重要意义。

本实验采用Trendelenburg卧位(头低脚高80°位置)构建高眼压动物模型[9]，结果显示，与正常组相比，模型组大鼠眼内压约升高了202.9%(P<0.01)，约为正常组的3倍，提示高眼压模型建立成功。且模型组大鼠视网膜明显增厚水肿，细胞层次不清晰，其血清中脂质过氧化物MDA的含量升高，抗氧化物酶SOD和GSH-Px活性明显下降，提示机体处于氧化应激状态。而经褪黑素(10 mg·kg-1)和Neu-P11(20、50 mg·kg-1)治疗后，机体各项指标都有不同程度的改善，趋于正常化，且Neu-P11(20 mg·kg-1)比高浓度Neu-P11(50 mg·kg-1)治疗效果更佳(P<0.05)。

Fig 4 Effects of Neu-P11 on MDA,SOD and GSH-Px activities in SD rat serum

Comparative effects of Neu-P11 on MDA content(A),SOD(B) and GSH-Px(C) enzyme activities in high IOP rats.*P<0.05,**P<0.01vsHIS group.

综上所述，Trendelenburg卧位状态下，SD大鼠眼内压升高，视网膜受损，机体处于氧化应激状态。褪黑素及其受体激动剂Neu-P11全身治疗可降低机体氧化应激水平，保护视网膜结构和功能的完整性，降低眼内压。总之， Neu-P11有降低大鼠高眼压状态下的眼内压的作用，这为青光眼的预防和治疗提供了一个广阔的发展前景。

(致谢：本实验在南华大学药学与生物科学学院生物化学与分子生物学实验室、南华大学心血管疾病研究所以及南华大学动物部完成。在此，对各位老师和同学的指导和帮助表示诚挚的谢意。)

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Neu-P11 reduces IOP through inhibiting oxidative stress level of acute high IOP rats

SHI Jin-feng1,ZHANG Xing-hui3,LI Mei-xiang1,SHE Mei-hua2,HE Peng-cheng2,TIAN Qi-xian1, Moshe Laudon5,YIN Wei-dong1,2,ZHANG Yao4
(1.InstituteofCardiovascularDisease, 2.DeptofBiotechnology，InstituteofPharmaceuticalandBiologicalSciences，UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China; 3.AierEyeHospitalofHengyang，HengyangHunan421001，China;4.theFirstPeople′sHospitalofChangde,ChangdeHunan415000，China;5.NeurimPharmaceuticalsLtd，Israel)

Aim To explore the effect of Neu-P11, a novel melatonin agonist with similar function of melatonin, on IOP of acute high IOP animals and the related mechanism. Methods The experiment used the Trendelenburg position(head low feet high position of 80°) to establish acute high IOP model. Rats were placed in the Trendelenburg position and used Tonopen XL contact tonometer to measure IOP (every 5 minutes measured once IOP, and the maximum value in 20 minutes) in 8 ∶00～9 ∶00 am. And then, thirty Sprague-Dawley rats(8 week-old) were divided into five groups: normal IOP+normal saline, high IOP+normal saline, high IOP+10 mg·kg-1Mel, high IOP+20 mg·kg-1Neu-P11, high IOP+50 mg·kg-1Neu-P11.Put in a flat to rest 2 h, animals were placed in Trendelenburg position again and then, IOP was measured every hour in the flat by 6 hours. After excessive sodium pentobarbital administration continuous for 1 week, the serum was collected and stored for subsequent detection at the end of the experiment. The level of MDA, SOD and GSH-Px enzyme activity of the rat serum was tested by kit accordingly. HE staining method was used to identify the SD rat retinal morphological changes.Results Trendelenburg position could induce IOP of model group rats, which was increased by 202.9%(P<0.01) and the content of MDA, reduced the activity of SOD and GSH-Px enzyme, retinal thickening was observed and its level was not clear. Neu-P11/Mel could significantly improve oxidative stress level and retinal edema in rats.Conclusion Neu-P11 could reduce IOP of the acute high IOP animals, which might be involved in the lower level of oxidative stress in the body.

Neu-P11; melatonin; intraocular pressure; Trendelenburg position; malondialdehyde;superoxide dismutase; glutathion peroxidase

2016-12-07,

2017-01-08

湖南省自然科学基金资助项目(No 14JJ2084)；湖南省教育厅基金项目(No 15C1203)；湖南省卫生计生委基金(No C2015-19)；南华大学‘蒸湘学者计划′资助(Xiangyang Tang)

石金凤(1977-)，女，博士生，研究方向：糖尿病的分子机制，E-mail：759843257@qq.com； 张 瑶(1991-)，女，硕士，研究方向：糖尿病的分子机制，通讯作者，E-mail：909878558@qq.com

时间：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.020.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.010

A

1001-1978(2017)05-0637-05

R-332；R322.91；R770.426；R775；R977.1