心肌IK1激动剂zacopride 抗左甲状腺素致大鼠心室重构作用的研究

郭云飞,杨 迎,刘 福,翟旭雯,张 研,李 盼,张 莉,吴博威,刘清华

(山西医科大学 1.病理生理学教研室、2.生理学教研室，山西 太原 030001；3. 山西省儿童医院临床检验中心，山西 太原 030001)

心肌IK1激动剂zacopride 抗左甲状腺素致大鼠心室重构作用的研究

郭云飞1,杨 迎1,刘 福1,翟旭雯2,张 研1,李 盼1,张 莉3,吴博威2,刘清华1

(山西医科大学 1.病理生理学教研室、2.生理学教研室，山西 太原 030001；3. 山西省儿童医院临床检验中心，山西 太原 030001)

目的 探讨心肌内向整流钾通道(IK1)激动剂zacopride对左甲状腺素致大鼠心室重构的抑制作用及可能的机制。 方法 SD大鼠，随机分为对照组，左甲状腺素模型组，zacopride 5、15、50 μg·kg-1干预组，zacopride (15 μg·kg-1)+ 氯喹(7.5 μg·kg-1)组和卡托普利阳性对照组。连续给药10 d。超声测量大鼠左室舒张期内径(LVIDd)、左室收缩期内径(LVIDs)、室间隔厚度(IVS)、左室射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)；测心肌肥厚指数；Langendorff急性分离成年大鼠单个心室肌细胞，全细胞膜片钳技术测量各组IK1电流、L-型钙通道(ICa-L)电流的变化； Fluo-4 激光共聚焦显微镜观察细胞形态，测胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)。 结果 与对照组比，左甲状腺素模型组全心和左心肥厚指数明显增加，LVIDd、LVIDs增大，IVS增厚， EF和FS明显降低(P<0.01)；IK1电流减小，ICa-L增加(P<0.01)；心室肌细胞增宽、肥大，[Ca2+]i增高(P<0.01)。Zacopride干预后，各指标均明显改善，15 μg·kg-1为最适效应剂量。氯喹7.5 μg·kg-1作为IK1通道相对特异性阻断剂，可阻断zacopride对IK1通道的激动效应，明显逆转zacopride的减轻钙超载和抗心室重构作用。结论 Zacopride可能通过选择性激动心肌IK1，减轻细胞内钙超载而逆转左甲状腺素诱发的心室重构。

内向整流钾通道；zacopride；左甲状腺素；心室重构；心肌肥大；钙超载

心衰是许多心血管疾病的最终病程，也是临床患者的主要致死原因。近年来，很多学者认为心室重构是心衰的标志性特征。心室肥大是心室重构进程中出现的结构改变，可作为一个独立的临床死亡危险因素，包括细胞、分子、代谢的一系列适应性变化到失代偿性改变，最终导致心衰。在心室重构的进程中，往往伴有某些离子通道、交换体和离子泵的变化，即电重构，如心肌电压门控钙通道电流 (L-Ca2+current,ICa-L) 的变化，瞬时外向钾电流(transient outward K+current,Ito)、ATP敏感性钾电流(ATP-sensitive potassium current,IKATP)和内向整流钾电流(inward rectifier potassium current,IK1)下调，钠钙交换电流[Na+-Ca2+exchanger (NCX) current,INa/Ca]增强及钠钾泵的抑制等[1-2]。因此，通过调节离子通道或转运体功能，进而逆转心室重构已成为当前心血管领域中重要的研究内容之一。

以往研究抗心室重构药物时，内向整流钾通道(IK1)是一个被忽视的靶点。IK1是心肌最主要的背景外向电流，参与静息电位(resting membrane potential，RMP) 的维持和心肌动作电位(action potential，AP) 3期终末的复极。其分子基础主要是内向整流钾通道基因Kir2.x亚家族。以往由于缺乏IK1通道特异性激动剂/阻断剂，极大限制了该通道功能的研究。我们首次报道了一个IK1通道特异性激动剂——zacopride[3]，利用这一药理学工具药，本研究希望通过观测zacopride对左甲状腺素钠致心室重构模型的作用，观察其是否能抗心室重构并改善心功能，同时，用IK1通道相对特异性阻断剂氯喹证实该设想，并与临床治疗药卡托普利做比较，评估其治疗效果。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级健康SD大鼠，♂，体质量(200～250)g，由山西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(晋)2015-0001。

1.2 药品与试剂 Zacopride hydrochloride购自TOCRIS，批号：3A/178109。优甲乐(左甲状腺素钠，L-thyroxine，L-thy)，规格为每片0.064 μmol，德国默克公司生产。氯喹(批号：BCBG0245V)、卡托普利(captoril)、牛磺酸(taurine)、L-谷氨酸(L-glutamicacid)、HEPES (N-2-hudroxyethylpiperazine-N′-2-ethane-sulfonic acid) 购自美国Sigma公司。胶原酶P购自瑞士Roche公司。其余均为国产分析纯产品。

优甲乐的有效成分为T4。将优甲乐片剂研磨后用生理盐水配制成1 g·L-1的混悬液，使用时按1 mg·kg-1·d-1取用。Zacopride原液：用去离子水配制为1 mmol·L-1储存液，使用时按需要稀释。氯喹(chloroquine)原液：用去离子水配制为1 mmol·L-1储存液，使用时按需要稀释。卡托普利(captoril)：用自来水溶解卡托普利，每天新鲜配制，使用时按100 mg·kg-1·d-1取用。台氏液(mmol·L-1)：NaCl 140， KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5.0，Glucose 10，MgCl21.0，CaCl21.8，用NaOH调节pH至7.38。酶液(mmol·L-1)：NaCl 125，KCl 5.4，CaCl275，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 10，Taurine 20，Collagenase P 0.1 g·L-1。KB液(mmol·L-1)：KOH 85，L-谷氨酸 50，KCl 30，Taurine 20，KH2PO430，MgCl21.0，HEPES 10，葡萄糖 10，EGTA 0.5，用KOH调节pH至7.4。

1.3 仪器 GE Vivid 7 Pro彩色超声诊断仪，10S探头，探头频率8.0 MHz，配备二维应变成像软件，Echo PAC工作站；Olympus FV1000激光共聚焦显微镜；Axopatch 200B膜片钳放大器(Molecular Device，USA)。

1.4 方法

1.4.1 实验分组 健康SD大鼠随机分为正常对照组、左甲状腺素模型组、zacopride 5、15、50 μg·kg-1干预组、zacopride (15 μg·kg-1) + 氯喹(7.5 μg·kg-1)组和卡托普利阳性对照组。

1.4.2 动物模型建立 方法根据吴晓冬等[4]修改。SD大鼠称重。除正常对照组外，其余各组动物均以混悬的优甲乐(1 mg ·kg-1·d-1)灌胃，正常对照组以等量的蒸馏水灌胃。Zacopride不同剂量组分别腹腔注射5、15、50 μg·kg-1zacopride，zacopride+氯喹组同时腹腔注射15 μg·kg-1zacopride和7.5 μg·kg-1氯喹，卡托普利阳性对照组按100 mg·kg-1·d-1饮水给予卡托普利。连续10 d。所有大鼠均饲以常规固体饲料和自来水，于停药24 h禁食过夜，然后观察相应指标。

1.4.3 超声心动图(ultrasound cardiograph, UCG)检查 用GE Vivid 7 Pro 超声仪配备的10S 探头并配备啮齿动物模式对大鼠心脏进行扫查，探查角度和深度尽量小，以提高帧频率，一般为15 °～30 °，深度为2 cm～3 cm，帧频 > 250·s-1，最高帧频可达400·s-1。在左心长轴切面上测量并记录大鼠心脏的左室内径(LVID)、室间隔厚度(IVS)，通过M型超声获得左室射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)，所有数据均测量3次，取其平均值。为了减小大鼠个体大小差异造成的误差，模型大鼠采用体表面积指数进行比较，其中LV指数=LVID·体表面积-1，IVS指数=IVS·体表面积-1。大鼠体表面积计算公式: 体表面积/m2=0.09 ×[体质量(kg)]2/3。

1.4.4 心肌肥厚指数的测定 停药24 h后称重(BW)。打开胸腔，快速取出心脏，置于4 ℃预冷的生理盐水，由主动脉逆行冲洗心脏血液后，用双层滤纸吸干水分，电子天平准确称量全心湿质量(HW)，去除心房及瓣膜组织，沿室间隔剪开左心室(包括室间隔)和右心室，去除大血管及心包组织，称量左心室(包括室间隔)质量(LVW)，最后计算全心质量·体质量-1(HW·BW-1，mg·g-1)比，左心室质量·体质量-1(LVW·BW-1，mg·g-1)比，分别记为全心肥厚指数、左心室肥厚指数。

1.4.5 分离单个左心室肌细胞，记录IK1电流，ICa-L电流 造模成功10 d后，各实验组动物分别取3只，在术前15 min腹腔注射肝素(1 000 U· kg-1)，戊巴比妥钠(65 mg·kg-1, ip)麻醉后颈动脉放血，迅速开胸取出心脏，置于4 ℃用100%氧气饱和的无钙台氏液中修剪，然后将心脏悬挂在Langendorff灌流装置上，经主动脉逆行灌流。先用无钙台氏液灌流8～10 min，再用酶液循环灌流15～20 min。灌流过程中保持37 ℃恒温，灌流压6.86 kPa，并持续通以100%氧气。待心室肌组织变大、变软后，选取左心室，置于KB液中剪碎，轻轻吹打得到分散的左心室肌细胞，经150 μm孔径的滤网过滤后，保存于KB液中，室温放置2 h后，用含钙台式液梯度复钙，记录IK1和ICa-L电流。

1.4.6 测定心室肌细胞内游离钙离子浓度 心肌细胞用PBS液冲洗2遍，用100 μL含5 μmol·L-1钙离子探针Fluo-4-AM滴于盖玻片上，37 ℃避光40 min，PBS液冲洗玻片3遍，洗去多余染料，保留少许PBS液平衡细胞10 min，于20 min内进行细胞内[Ca2+]i检测。加载好荧光染料的细胞置于共聚焦激光扫描镜的载物台上，进行形态观测，随机选取心肌细胞，计算心肌细胞表面积，测定胞内游离钙的荧光值。

2 结果

2.1 扎考比利对左甲状腺素模型大鼠心肌肥厚的影响

2.1.1 超声心动图结果 与正常对照组相比，左甲状腺素模型组大鼠左室收缩期内径(LVIDs)、舒张期内径(LVIDd) 、室间隔厚度(IVS)均明显增加(P<0.01)，射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)明显降低(P<0.01)，提示心室肥厚和左心功能降低。大鼠经zacopride (15 μg·kg-1)预防性给药后，左室收缩期内径、舒张期内径、室间隔厚度均较模型组明显降低(P<0.01)，EF、FS明显升高(P<0.01)，心功能恢复至正常或接近正常水平。应用低剂量氯喹(7.5 μg ·kg-1，IK1通道相对特异性阻断剂)阻断zacopride对IK1通道的激动效应，则可明显抑制zacopride的抗心室重构作用，提示zacopride可能通过激动心肌IK1通道而发挥抗心室重构效应。见Tab 1、Fig 1。

Fig 1 Echocardiography of L-thyroxine-induced cardiac hypertrophy in rats

A：Control; B：L-thyroxine; C:L-thyroxine+zacopride; D：L-thyroxine+zacopride+chloroquine.

2.1.2 大鼠心肌肥厚指数变化 大鼠灌胃给予左甲状腺素钠连续10 d后，全心肥厚指数(P<0.01)、左心室肥厚指数(P<0.01)较正常对照组明显增加，说明心肌肥厚模型复制成功。5～50 μg ·kg-1zacopride可剂量依赖性拮抗心肌肥厚，其全心肥厚指数、左心室肥厚指数均较模型组降低。15 μg·kg-1为zacopride最适效应剂量(P<0.01)，其效应与卡托普利组相比差异无显著性(P>0.05)；而同时应用低剂量氯喹(7.5 μg·kg-1，IK1通道相对特异性阻断剂)则可明显抑制zacopride的抗心室重构作用，提示zacopride可能通过激动心肌IK1通道而发挥抗心室重构效应。见Tab 2。

2.2IK1和ICa-L的变化

2.2.1IK1的变化 左甲状腺素致心室重构模型中，IK1通道内、外向电流均被抑制，其中外向电流(-60 mV)减少25.7%[由(3.31 ± 0.36) pA·pF-1减少至(2.46 ± 0.19) pA·pF-1,P<0.01]；zacopride可使外向电流恢复至 (3.19 ± 0.29) pA·pF-1(P<0.01)，提示zacopride可以逆转模型组IK1电流的减少；zacopride的效应可以被低剂量氯喹消除，外向电流(-60 mV)降低17.9%，由(3.19 ± 0.29) pA·pF-1减少至(2.62 ± 0.13) pA·pF-1(P<0.01)，见Fig 2。

Fig 2 Effect of zacopride on IK1in hypertrophic rat ventricular myocytes

The dose of zacopride is 15 μg·kg-1.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsL-thy;##P<0.01vsL-thy+Zac+Chlo.

2.2.2ICa-L的变化ICa-L通道的变化则与IK1通道完全相反。左甲状腺素致心室重构模型中ICa-L通道在0 mV处电流增加59.5%，由(-8.03 ± 0.56) pA·pF-1增至(-12.81 ± 0.53) pA·pF-1(P<0.01)； zacopride可使ICa-L降低至(-9.29 ± 0.52) pA·pF-1(P<0.01)，提示zacopride可以逆转模型组ICa-L电流的增加；zacopride的效应可以被低剂量氯喹消除，0 mV处ICa-L电流增至(-11.63 ± 0.28) pA·pF-1(P<0.01)。见Fig 3。

nLVIDd/mm·m-2LVIDs/mm·m-2IVS/mm·m-2EF/%FS/%Control6118．92±19．62 75．37±11．81 51．63±4．40 73．0±0．82 36．5±0．58 L⁃thy8181．5±19．60∗∗140．68±12．97∗∗68．23±4．13∗∗60．8±4．66∗∗28．3±3．3∗∗L⁃thy+Zac8126．33±25．00△△##86．55±13．92△△##53．14±5．02△△##78．5±6．45△△##41．5±6．86△△##L⁃thy+Zac+Chlo6157．08±27．29∗∗113．56±12．28∗64．58±3．47∗∗62．3±7．15∗∗25．5±6．36∗∗

L-thy:L-thyroxine; Zac: zacopride; Chlo: chloroquine. The dose of zacopride is 15 μg·kg-1. LVIDd: left ventricular dimension in diastole; LVIDs: left ventricular dimension in systole; IVS: interventricular septum thickness; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsL-thy;##P<0.01vsL-thy+Zac+Chlo

Fig 3 Effect of zacopride on ICa-L in hypertrophic rat ventricular myocytes

The dose of zacopride is 15 μg·kg-1.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsL-thy;##P<0.01vsL-thy+Zac+Chlo.

2.3 单个心室肌细胞形态观察及胞内游离钙浓度的变化 在镜下可见左甲状腺素模型大鼠左心室肌细胞宽度明显增加，细胞表面积明显增大(P<0.01)，胞内游离钙离子浓度增加明显(P<0.01)，15 μg·kg-1zacopride干预后，细胞形态和胞内钙浓度恢复至正常或接近正常水平(P<0.01)，低剂量氯喹可以消除zacopride的效应(P<0.01)。见Tab 3、Fig 4。

Fig 4 Zacopride inhibited L-thyroxine-induced intracellular calcium-overload in rat ventricular myocytes

A: Control; B:L-thy; C:L-thy+Zac; D:L-thy+Zac+Chlo.The dose of zacopride is 15 μg·kg-1.

nBW/gHW·BW-1/mg·g-1LVW·BW-1/mg·g-1Control6233．6±12．42．53±0．041．51±0．07L⁃thy8243．8±10．74．56±0．65∗∗3．17±0．24∗∗L⁃thy+Zac5μg·kg-16245．5±14．33．94±0．22△△2．79±0．16△△L⁃thy+Zac15μg·kg-18248．3±9．03．96±0．27△△2．74±0．23△△L⁃thy+Zac50μg·kg-16243．0±5．14．29±0．23△2．90±0．20△L⁃thy+Zac15μg·kg-1+Chlo6231．5±19．64．60±0．35##3．10±0．31##Captopril6229．3±12．24．05±0．15△2．80±0．16△△

**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsL-thy;##P<0.01vsL-thy+Zac 15 μg·kg-1.

Width/μmArea/μm2[Ca2+]i(CHS1)Contro21±4．3 2369±81．5 992±115．7L⁃thy33±8．1∗∗4257±101．3∗∗2660±170．7∗∗L⁃thy+Zac24±9．2△△##3179±90．2△△## 909±83．2△△##L⁃thy+Zac+Chlo29±7．33891±113．81477±96．0

The dose of zacopride is 15 μg·kg-1.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsL-thy;##P<0.01vsL-thy+Zac+Chlo.

3 讨论

心室重构包括组织重构和电重构两部分，组织重构即心肌细胞形态，排列和间质的变化，以心肌细胞肥大及间质纤维化为特点；电重构即心肌细胞膜离子通道、交换体和离子泵的变化。Kääb等[5]于1998年就报道了心衰病人动作电位时程(action potential duration，APD)延长，瞬时外向钾电流Ito电流减少，内向整流钾通道IK1密度下降的现象； Zobel等[6]则认为Ito的减少，钙内流的增加，是心肌肥大电重构的主要机制。电重构不仅是心肌肥大的结果，还可先于组织重构发生，进而影响组织重构过程[7]，这提示研究者需重新探究电重构与组织重构的关系，并尝试将离子通道作为有效干预心室重构的新靶点。

甲状腺素是甲状腺分泌的激素，主要有四碘甲状腺原氨酸(thyroxine, T4)和三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine, T3)两型。甲状腺素通过基因或非基因作用对心血管系统产生多种效应、包括心肌收缩效应、电生理功能和心肌结构改变等[8]。过量的甲状腺激素作用于心脏上的甲状腺素核受体-α(thyroid hormone nuclear receptor α, TR-α)，通过一系列的下游信号级联反应，产生心肌肥大[8]。与此同时，甲状腺素还可通过非基因组效应影响细胞膜上离子，如Ca2+、Na+、K+的转运[9-10]。心室肥大的早期可以通过细胞肥大增强收缩功能，是一种适应性变化，又称生理性肥大，之后心室肥大会渐变为不可逆性的破坏性变化，收缩和舒张功能受损，产生病理性肥大，最终产生心衰。在这一过程中，钙稳态失衡被认为是心肌肥大发生的中心环节[11-12]。细胞膜上L型钙通道、NCX交换体，肌浆网的Ca2+-ATP酶、Ryanodine受体及钙调蛋白激酶Ⅱ(calmodulin kinase Ⅱ, CaMKⅡ)、钙调磷酸酶(calcineurin)等钙调蛋白的功能异常均是导致胞内钙稳态失衡的可能机制。由于L型钙通道介导的Ca2+内流是心肌兴奋收缩偶联的始动环节，因而在探讨钙稳态失衡致心肌肥大的机制时，钙通道异常往往是首先考虑的因素。本研究结果显示，左甲状腺素诱发的心肌肥大，心肌细胞膜上内向整流钾通道电流(IK1)被抑制，而L型钙通道电流(ICa-L)明显增大，胞内[Ca2+]i增多，发生了钙超载。经zacopride干预后，IK1增大，ICa-L减小，接近正常水平，并明显降低胞内[Ca2+]i,说明zacopride可通过减轻细胞内钙超载而发挥抗心室重构效应。本课题组曾首次报道zacopride为心肌IK1特异性激动剂，可增大RMP，适度缩短APD，但其对心肌ICa-L无明显影响[3]。如何解释zacopride抑制左甲状腺素诱发的ICa-L电流，进而减轻钙超载呢？ 我们认为在心室重构进程中，zacopride不直接抑制心肌ICa-L，很可能通过激动IK1而增大RMP，缩短APD，两者均可减少电压门控Ca2+内流，减轻细胞内钙超载，从而发挥抗心室重构效应。

有研究表明，肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensin-system，RAS)参与了甲状腺素增多所产生的心肌肥大的过程[13]，但具体的信号转导机制还不明确。Zacopride选择性激动IK1之后的下游信号机制有待进一步研究。可以尝试联合使用血管紧张素转换酶抑制剂。

综上所述，本研究建立左甲状腺素致心室重构模型，首次利用zacopride和相对特异性IK1通道阻断剂氯喹，证明通过选择性激动心肌IK1通道可能通过减轻细胞内钙超载而发挥抗心室重构效应，但其对钙诱导的心室重构信号通路的调节作用仍需进一步研究明确。

(致谢：本研究在山西医科大学病理生理实验室、生理实验室完成，感谢李夏青老师、赵录英老师的支持和指导。)

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Effect ofIK1agonist zacopride onL-thyroxine-induced ventricular remodeling in rats

GUO Yun-fei1, YANG Ying1, LIU Fu1, ZHAI Xu-wen2, ZHANG Yan1, LI Pan1, ZHANG Li3, WU Bo-wei2， LIU Qing-hua1
(1.DeptofPathophysiology, 2.DeptofPhysiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China; 3.ShanxiProvincialChildren’sHospital,Taiyuan030001,China)

Aim To examine the effect of zacopride, a specific inward rectifier potassium channel (IK1) agonist, onL-thyroxine (T4)-induced ventricular remodeling and the underlying mechanism. Methods SD rats were randomly divided as control,L-thyroxine (L-thy, 1 mg·kg-1·d-1, ig, 10 d) model,L-thy +zacopride (5, 15, 50 μg·kg-1, respectively, ip),L-thy+zacopride (15 μg·kg-1)+chloroquine (7.5 μg·kg-1, ip) andL-thy+captopril (100 mg·kg-1·d-1, drinking water) groups. Echocardiography and cardiac hypertrophic indexes were measured to confirm the establishment of the ventricular remodeling model. The changes ofIK1and L-calcium current (ICa-L) were detected by whole cell patch clamp technique. The confocal microscopy and fluorescent indicator Fluo-4 were applied to examine the intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i) of isolated adult rat ventricular myocytes. ResultsL-thyroxine induced left ventricular hypertrophy with increased ratio of heart weight (HW) to body weight (HW·BW-1), ratio of left ventrical weight (LVW) to body weight (LVW·BW-1), left ventricular dimension in diastole (LVIDd), left ventricular dimension in systole (LVIDs), interventricular septum thickness (IVS) and decreased ejection fraction(EF), fractional shortening (FS) (P<0.01). Patch clamp data suggestedIK1was downregulated, whileICa-Lwas upregulated (P<0.01). In isolated adult cardiomyocytes,L-thyroxine increased the cell area and [Ca2+]i(P<0.01). Zacopride treatment obviously alleviated cardiac remodeling, improved cardiac function, reversed the changes ofIK1andICa-L, and significantly attenuated intracellular calcium overload (P<0.01). The optimum dose of zacoprideinvivowas 15 μg·kg-1at which the effect was compared favourably with captopril, a classical anti-remodeling agent. Low-doseIK1atagonist chloroquine could reverse the effect of zacopride (P<0.01). Conclusion Via activatingIK1, zacopride could significantly decrease Ca2+influx and intracellular calcium overload thereby inhibitingL-thyroxine-induced cardiac ventricular remodeling.

inward rectifier potassium channel; zacopride;L-thyroxine; ventricular remodeling; cardiac hypertrophy；calcium overload

2016-12-24，

2017-01-23

国家自然科学基金资助项目(No 31200864)；山西省回国留学人员科研资助项目(No 2016-059)

郭云飞(1989 -)，女，硕士生，研究方向：心血管生理与药理学，E-mail：1013784511@qq.com； 刘清华(1974 -)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：心血管生理与药理学，通讯作者，E-mail：liuqh20041206@163.com

时间：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.022.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.011

A

1001-1978(2017)05-0641-06

R-332；R322.11；R331.31；R541.610.5