基于TLR4-NF-κB 的柴胡黄芩水煎液抑制CCl4诱导大鼠肝星状细胞激活作用机制研究

李 敏，韩 艳，王华林，王義雯，李 静，王 斌

(陕西中医药大学药学院 ，陕西 西安 712046)

基于TLR4-NF-κB 的柴胡黄芩水煎液抑制CCl4诱导大鼠肝星状细胞激活作用机制研究

李 敏，韩 艳，王华林，王義雯，李 静，王 斌

(陕西中医药大学药学院 ，陕西 西安 712046)

目的 探讨柴胡黄芩水煎液(CQ)对CCl4诱导肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)激活的作用及机制。方法 取对数生长的HSC，在无血清培养基中培养24 h后，以1.5×109·L-1浓度接种到培养板中过夜。实验分组如下：空白对照组(无药物处理)，CCl4诱导组(6 mmol·L-1CCl4作用6 h)，给药组(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用400、500、600 mg·L-1的CQ作用24 h)，TLR4阻断剂TAK-242、NF-κB阻断剂BAY 11-7082组(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用TAK-242 10 mol·L-1、BAY 11-7082 2 mol·L-1作用24 h)。处理之后，应用ELISA法检测培养基中透明质酸酶(hyaluronidase，HA)、层黏连蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前胶原(procollagen Ⅲ，PCⅢ)、Ⅳ型胶原(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C)浓度，RT-PCR方法检测细胞中Toll样受体4(Toll-like receptors 4，TLR4)、核转录因子κB(NF-κB)基因的表达，应用Western blot法检测细胞中TLR4、NF-κB蛋白的表达。结果 研究发现，与CCl4干预组比较，CQ量效相关性降低CCl4诱导的HSC增殖。600 mg·L-1的CQ可以明显降低HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C细胞释放水平及TLR4、NF-κB基因、蛋白的表达。NF-κB抑制剂TAK-242、BAY 11-7082也可降低CCl4造成的HSC增殖，HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C细胞释放水平及NF-κB基因、蛋白表达，不能下调TLR4基因、蛋白表达。结论 CQ可以抑制CCl4诱导的炎症因子基因、蛋白表达，减轻肝纤维化相关指标的含量，其作用机制可能与TLR4-NF-κB转录活性及蛋白活性相关，提示其在抗肝纤维中的作用及机制。

肝纤维化；柴胡-黄芩水煎液；HSC；CCl4诱导；TLR4；NF-κB

肝纤维化是多种肝损伤发展过程中的一种病理状态,肝纤维化过程中肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)持续激活是肝纤维化发展过程中的关键环节。HSC在多种因素刺激后被激活转换成为肌成纤维样细胞，细胞大量增殖，合成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)并在肝脏过度沉积,产生肝纤维化[1]。课题组前期研究表明，柴胡黄芩配伍水煎液(CQ)对大鼠肝纤维化模型有良好的保护作用[2]，对四氯化碳(CCl4)损伤L02细胞有良好的保护作用[3]。在此基础上，本研究进一步观察柴胡黄芩水提液对HSC增殖的影响以及干预CCl4诱导活化HSC的作用。从体内TLR4-NF-κB信号通路的角度阐释柴胡黄芩水煎液抗肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 大鼠肝星状细胞株HSC-T6，购自灏洋生物公司；改良型RPMI 1640培养基，购自博士德生物科技公司；胎牛血清，购自Hyclone公司；胰酶，购自Trypsin。TAK-242购自 InvivoGen 公司；BAY 11-7082购自江苏碧云天生物工程公司；透明质酸酶(hyaluronidase，HA)、层黏连蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前胶原(procollagen Ⅲ，PCⅢ)、Ⅳ型胶原(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C)检测试剂盒购自北京永辉生物科技有限公司；TLR4、NF-κB p65一抗、二抗购自武汉博士德生物工程公司。CO2培养箱:新加坡ESCO；倒置显微镜: 奥特BDS200；酶标仪: 美国BioTek ELx808；离心机: 湘仪L530；双人型超净工作台：新加坡ESCO。

1.2 实验药品

1.2.1 柴胡黄芩配伍水提液 中药材柴胡和黄芩购自陕西中医药大学校医院中药房，经鉴定为正品。参照文献及前期实验结果，称取柴胡50 g和黄芩25 g，用水浸泡30 min后，以8倍水煎煮2次，将2次水提液混匀浓缩至75 mL。

1.2.2 CCl4溶液的制备 将100 μL CCl4与100 μL DMSO混匀，再用无血清培养基稀释，使其终浓度为6 mmol·L-1。

1.3 大鼠HSC培养及药物处理 大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)于改良型RPMI 1640培养基(含10%的胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素)，37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养并传代。取对数生长的HSC，在无血清培养基中培养24 h后，以1.5×109·L-1浓度接种到培养板中过夜。实验分组如下：空白对照组(无药物处理)，CCl4诱导组(6 mmol·L-1CCl4作用6 h)，给药组(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用400、500、600 mg·L-1的CQ作用24 h)，TLR4阻断剂TAK-242、NF-κB阻断剂BAY 11-7082组(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用TAK-242 10 mol·L-1、BAY 11-7082 2 mol·L-1作用24 h)。

1.4 CQ对CCl4诱导活化的HSC增殖的影响 各组培养24 h后，加入5 g·L-1MTT 10 μL，37℃孵育4 h，吸弃孔内培养液，每孔加入DMSO 150 μL,低速震荡10 min，以溶解被还原的MTT结晶，酶标仪单波长检测各孔吸光度值，按下列公式计算大鼠HSC增殖抑制率。细胞抑制率/%=[1-(实验组A值/对照组A值)]×100%。

1.5 CQ对CCl4诱导活化的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影响 各组培养24 h后，收集细胞培养液，参照试剂盒使用说明书，应用ELISA法检测HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量。

1.6 CQ对CCl4诱导活化的HSC细胞TLR4和NF-κB p65的mRNA水平的影响 各组培养24 h后，弃去上清液，胰酶消化收集，至少以1×106个为样本检测量。孵育24 h后抽提细胞总RNA，去除DNA污染后，通过RT-PCR的方法，检测TLR4和NF-κB p65 mRNA表达，PCR引物序列见Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

1.7 CQ对CCl4诱导活化的HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表达的影响 各组培养24 h后，弃去上清液，胰酶消化收集，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂充分裂解，4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min。取上清，BCA试剂盒蛋白定量，细胞总蛋白加上样缓冲液煮沸变性，用10% SDS-PAGE分离蛋白，转膜后，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温杂交2 h，洗膜后，加入ECL发光液，进行检测，观察结果并扫描分析。TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平用目的条带积分吸光度值(integrated absorbance，IA)与内参GAPDH蛋白条带的IA比值定量表示。

2 结果

2.1 CQ对CCl4诱导活化的HSC增殖的影响 与空白对照组比较，CCl4干预后，明显促进HSC增殖(P<0.01)，CQ对CCl4诱导的HSC增殖具有明显抑制作用，特别是剂量为600 mg·L-1时，作用最为明显；TAK-242和BAY 11-7082也对CCl4诱导的HSC增殖具有明显抑制作用。见Tab 2。

GroupDoseODvalueNormal-0．32±0．14∗∗CCl46mmol·L-10．54±0．08CQ600mg·L-10．33±0．06∗∗500mg·L-10．36±0．07∗400mg·L-10．40±0．08∗TAK⁃24210mol·L-10．31±0．15∗BAY11⁃70822mol·L-10．33±0．10∗∗

*P<0.05,**P<0.01vsCCl4group

2.2 CQ对CCl4诱导活化的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影响 与空白对照组比较，CCl4干预后，HSC细胞分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量明显升高，CQ、TAK-242 和BAY 11-7082对CCl4诱导的HSC细胞分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C具有明显抑制作用，特别是CQ剂量为600 mg·L-1时，作用最为明显。见Tab 3。

2.3 RT-PCR检测大鼠HSC中TLR4和NF-κB p65 mRNA表达 与空白对照组比较，CCl4干预后，HSC中TLR4和NF-κB p65 mRNA表达增强，CQ和BAY 11-7082对CCl4诱导的HSC细胞TLR4和NF-κB p65 mRNA表达有下调作用，TAK-242对CCl4诱导的HSC细胞NF-κB p65 mRNA表达有下调作用，其中CQ 600 mg·L-1组、TAK-242和BAY 11-7082组差异有统计学意义(P<0.05)，见Tab 4。

2.4 Western blot法检测HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表达 与空白对照组比较，CCl4干预后，HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表达增强，CQ、TAK-242对CCl4诱导的HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表达有下调作用，BAY 11-7082对CCl4诱导的HSC中NF-κB p65蛋白表达有下调作用，其中CQ 600 mg·L-1、TAK-242和BAY 11-7082组差异有统计学意义(P<0.05)，见Tab 5、Fig 1。

GroupDoseHA/μg·L-1Ⅳ⁃C/μg·L-1LN/μg·L-1PCⅢ/μg·L-1Normal-234．26±29．64∗∗10．69±2．01∗∗42．67±6．28∗∗80．21±7．61∗∗CCl46mmol·L-1498．36±98．0825．34±2．6471．25±10．21142．65±9．92CQ600mg·L-1326．94±72．06∗11．54±2．90∗∗46．42±12．03∗∗89．29±10．24∗∗500mg·L-1376．22±69．49∗15．02±2．87∗56．15±9．52∗115．39±10．04∗400mg·L-1473．67±72．8423．64±2．9159．21±11．65138．57±11．68TAK⁃24210mol·L-1259．26±59．37∗∗12．89±2．98∗43．24±9．87∗∗90．21±12．54∗∗BAY11⁃70822mol·L-1309．18±81．65∗11．03±1．24∗∗40．21±10．24∗∗84．15±9．34∗∗

*P<0.05,**P<0.01vsCCl4group

GroupDoseNF⁃κBTLR4Normal-20．90±0．50∗38．32±2．83∗CCl46mmol·L-124．37±0．4742．40±1．55CQ600mg·L-121．34±1．92∗40．02±0．03∗500mg·L-122．46±0．1842．01±1．19400mg·L-123．45±0．1844．00±0．63TAK⁃24210mol·L-121．45±1．20∗42．19±0．82BAY11⁃70822mol·L-123．24±0．08∗41．19±3．10∗

**P<0.01,*P<0.05vsCCl4group

GroupDoseNF⁃κBTLR4Normal-0．35±0．00∗0．20±0．01∗CCl46mmol·L-10．80±0．020．60±0．02CQ600mg·L-10．14±0．03∗∗0．16±0．01∗∗500mg·L-10．24±0．02∗0．18±0．00∗400mg·L-10．61±0．010．16±0．04∗TAK⁃24210mol·L-10．18±0．03∗0．14±0．02∗∗BAY11⁃70822mol·L-10．15±0．02∗∗0．52±0．01

*P<0.05,**P<0.01vsCCl4group

Fig 1 Effect of CQ on protein expressions of TLR4,NF-κB in HSC

1: Normal group; 2: CCl4group; 3: CQ 600 mg·L-1group; 4: CQ 500 mg·L-1group; 5: CQ 400 mg·L-1group; 6: TAK-242; 7:BAY 11-7082

3 讨论

TLR4是细胞表面识别病原相关分子的一个重要识别受体，该受体激活后能通过信号转导激活其下游的NF-κB，导致炎性介质大量释放，引起肝脏损害[4-6]。经刺激活化的HSC是肝纤维化ECM的主要来源细胞。HSC在多种因素刺激后被激活转换成为肌成纤维样细胞,细胞大量增殖，合成ECM,并在肝内过量沉积,发生肝纤维化，可见，TLR4-NF-κB信号通路异常与肝损伤关系密切[7-8]。文献研究[9-11]及课题组前期实验发现，柴胡黄芩配伍水煎剂有明显防治大鼠肝纤维化作用，其体内调控机制可能与TLR4-NF-κB信号通路调控的炎症反应有关[1]。本实验通过研究柴胡黄芩配伍水煎剂对HSC增殖影响，及对CCl4诱导活化后的HSC的分泌功能、TLR4和NF-κB p65基因及蛋白表达的影响，探讨其抗肝纤维化可能的作用机制。

实验结果显示，HSC经CCl4激活，大量增殖,其培养液中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量明显高于空白对照组。可见，CCl4对HSC增殖有一定激活作用，导致肝纤维化相关因子HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C分泌增加，表现出肝纤维化倾向。给予CQ干预后，HSC增殖受到一定抑制，并且HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量也降低，可见，CQ有一定抗肝纤维化作用。通过RT-PCR法和Western blot法检测CCl4活化后的HSC中TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达，与空白组比较，TLR4和NF-κB p65 mRNA表达和蛋白表达均明显增加，CQ干预后，TLR4和NF-κB p65 mRNA表达和蛋白表达均明显降低，其中CQ 600 mg·L-1时作用最为明显。同时，应用TLR4的拮抗剂TAK-242后，TLR4和NF-κB p65 mRNA表达和蛋白表达明显降低，而应用NF-κB p65拮抗剂BAY 11-7082后，NF-κB p65 mRNA表达和蛋白表达也明显降低，TLR4 mRNA表达和蛋白表达没有明显变化。可见，CQ能够减轻CCl4激活HSC的增殖，并降低肝纤维化因子HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量，其作用机制之一是通过调控TLR4-NF-κB信号通路，具体的调控机制，还需进一步研究。

(致谢：本文实验在陕西中医药大学医学科研实验中心完成，在整个研究过程中得到了王宇老师、史迎莉的悉心指导和热忱帮助，在此次深表谢意！)

[1] Sahin H，Trautwein C，Wasmuth H E.TLR4 stresses the liver[J].Gut，2012，61(9):1241-2.

[2] 王 斌，李 敏，侯建平.基于TLR4-NFκB信号通路的柴胡-黄芩药对抗肝纤维研究[J].中药药理与临床，2015，31(3):103-6.

[2] Wang B，Li M，Hou J P.Study of Bupleurum-Scutellariaon hepatic fibrosis in rats based on TLR4-NF-κB signal pathway[J].PharmacolClinChinMaterMed，2015，31(3):103-6.

[3] 李小菲，李 静，王義雯，等.柴胡、柴胡和黄芩配伍对肝细胞损伤体外作用[J]. 吉林中医药，2016，36(2):176-80.

[3] Li X F，Li J，Wang X W，et al.Water extraction from radix bupleuri and compatibility of radix bupleuri and scutellaria baicalensis georgi on carbon tetrachloride-injured hepatocyteinvitro[J].JilinJTraditChinMed，2016，36(2) :176-80.

[4] Zhu Q，Zou L，Jagavelu K，et al.Intestinal decontamination inhibits TLR4 dependent fibronectin-mediated cross-talk between stellate cells and endothelial cells in liver fibrosis in mice[J].Hepatology，2012，56(4):893-9.

[5] Yu M,Shao D B,Liu J,Zhu J. Effects of ketamine on levels of cytokines, NF-κB and TLRs in rat intestine during CLP-induced sepsis[J].IntImmunopharmacol，2007，7(8):1076-82.

[6] 谷元婧，孙妩弋，张 森，等.β-arrestins与纤维化疾病的研究进展[J].中国药理学通报, 2015，31(2)：171-5.

[6] Gu Y J，Sun W Y，Zhang S，et al.Advances in the study of β-arrestins and fibrosis[J].ChinPharmacolBull,2015，31(2)：171-5.[7] Wu Y H,Yang L X,Wang F,et al. Hepatoprotective and antioxidative effects of total phenolics from Laggera pterodonta on chemical-induced injury in primary cultured neonatal rat hepatocytes[J].FoodChemToxicol，2007，45(8):1349-55.

[8] 李 冬，戴立里，余斌斌，等.丹参素对大鼠肝星状细胞增殖、凋亡及NF-κB活性的影响[J]. 第三军医大学学报，2009，31(8):724-7.

[8] Li D，Dai L L，Yu B B，et al.Tanshinol induces proliferation,apoptosis and NF-κB activation in cultured rat hepatic stellate cells after IL-1β inducement[J].ActaAcadMedMilTert,2009，31(8):724-7.

[9] 纪 辉，迟宝荣，张一宁.肝纤维化与肝星状细胞[J]. 吉林大学学报(医学版)，2008，34(3):538-41.

[9] Ji H，Chi B R，Zhang Y N.Liver fibrosis and hepatic stellate cells[J].JJilinUniv(MedEd)，2008，34(3):538-41.

[10]郑丽娜，韩 涛，王宝恩，等.柴胡对肝星状细胞胶原蛋白分泌的影响[J]. 天津医科大学学报，2001，7(4):502-3.

[10]Zheng L N，Han T，Wang B E，et al.Effect of Bupleurum on collagen content in hepatic stellate cell mediainvitro[J].JTianjinMedUniv，2001，7(4):502-3.

[11]刘林华，许景薇，万玉英，等.猪牙皂正丁醇提取物体外对肝星状细胞活性的影响研究[J].抗感染药学，2015，12(6):832-4.[11]Liu L H，Xu J W，Wan Y Y，et al.Study on the effect of hepatic stellate cell activity of Fructus Gleditsiae n-butanol extract [J].Anti-InfecPharm，2015，12(6):832-4.

Inhibitory effects ofBupleurumchinense-Scutellariabaicalensisdecoction on activation of rat HSC induced by CCl4

LI Min, HAN Yan, WANG Hua-lin,WANG Yi-wen,LI Jing,WANG Bin
(CollegeofPharmacy,ShanxiUniversityofChineseMedicine,Xian712046,China)

Aim To investigate the inhibitory effect ofBupleurumchinense-Scutellariabaicalensisdecoction(CQ) on activation of rat HSC induced by CCl4and the mechanism.Methods Cells in logarithmic growth phase were cultured in culture medium without FBS for 24 h.After disassociated using 0.25% EDTA-trypsin, the cells were seeded into respective plates at the density of 1.5×109· L-1and cultured overnight. The cells were divided into the following groups:control group(no treatment)，model group(treated with 6 mmol·L-1CCl4for 24 h)，CQ groups(pretreated with 6 mmol·L-1CCl4for 24 h and 400,500,600 mg·L-1CQ for 24 h). Concentrations of hyaluronidase(HA), laminin(LN), procollagen Ⅲ(PCⅢ),collagen type Ⅳ(Ⅳ-C) were assayed by ELISA kits. Gene expressions of Toll-like receptor 4 (TLR4) and NF-κB were examined by RT-PCR analysis. Protein expression of TLR4 and NF-κB was examined by Western blot.Results CQ could significantly inhibit cell proliferation induced by CCl4. Furthermore, CQ at 600 mg·L-1significantly downregulated gene and protein expressions of TLR4 and NF-κB. And CQ reduced the secretion of HA,LN,PCⅢ,Ⅳ-C. Further studies disclosed that the TLR4 inhibitor TAK-242 and NF-κB inhibitor BAY 11-7082 could significantly inhibit the gene and protein expressions of NF-κB，but could not change gene and protein expression of TLR4,and reduced the secretion of HA,LN,PCⅢ,Ⅳ-C. Conclusion CQ could inhibit inflammatory responses in HSC induced by CCl4probably by inhibiting the transcription activity and protein expression of TLR4-NF-κB, which indicates its possible therapeutic effect on liver fibrosis.

liver fibrosis;Bupleurumchinense-Scutellariabaicalensisdecoction; HSC; induced by CCl4; TLR4; NF-κB

2016-12-28,

2017-01-22

陕西省科技厅项目(No 2013jk4023)； 陕西省中医药管理局项目(No zy06)；陕西省教育厅项目(No 12JK1016)

李 敏(1978-)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药基础理论，E-mail：413159921@qq.com； 王 斌(1978-)，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：中医药抗脑缺血，通讯作者，E-mail：wangbin812@126.com

时间：2017-4-24 11:21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1121.052.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.026

A

1001-1978(2017)05-0729-04

R-332；R282.71；R283.6；R322.47；R392.11；R575.2；R977.6