超声评价法优化三氯化铁诱导大鼠颈总动脉血栓模型的研究☆

滕雨明金海强邢海英范成河刘媛媛南丁孙永安黄一宁

·论 著·

超声评价法优化三氯化铁诱导大鼠颈总动脉血栓模型的研究☆

滕雨明*金海强*邢海英*范成河*刘媛媛*南丁*孙永安*黄一宁

目的 探讨采用连续超声评价法优化不同三氯化铁浓度梯度和作用时间诱导大鼠颈总动脉血栓模型，为溶栓及取栓研究提供合适的在体血栓模型。方法 选取20只(Sprague–Dawley)SD大鼠，每组5只，分别采用20%、30%、40%、50%四种三氯化铁浓度外敷大鼠单侧颈总动脉，使用14 L高频超声探头，分别在外敷10 min、15 min、20 min三个时间点观察血管二维超声图像及彩色多普勒血流情况。选取血管闭塞最佳组大鼠，于干预120 min后观察血管自发再通率及静脉注射尿激酶后的血管再通率。实验结束后，取出干预血管甲醛固定，石蜡包埋，切片，进行HE染色病理分析。结果 三氯化铁外敷大鼠颈总动脉20 min、50%浓度组血管闭塞率100%，40%、30%、20%浓度组外敷20 min血管闭塞率分别20%、0%、0%(P＜0.001)。外敷120 min后，50%浓度组组血管自发再通率0%、40%、30%、20%组血管自发再通率100% (P＜0.001)，50%三氯化铁浓度造模组尾静脉注射尿激酶后血管部分再通率为40%。50%浓度组镜下病理显示血栓结构致密，尿激酶干预后管腔部分再通，血栓结构松散。结论 采用50%三氯化铁浓度外敷大鼠颈总动脉20 min，可能是在体血栓模型形成的有效条件，该动物模型可能适合溶栓研究。

动物模型 三氯化铁诱导血栓 闭塞血栓 超声评价

1990年，KURZ等[1]，将三氯化铁外敷于大鼠颈总动脉诱导闭塞性血栓形成，同时发现血管闭塞时间依赖于三氯化铁溶液浓度，浓度越高,闭塞性血栓形成越快，浓度越低，闭塞血栓形成越慢。此方法形成的血栓为富含血小板、纤维蛋白和红细胞的混合型血栓，与临床自发性血栓组织形态学特征相似[2]。国际通用的血栓模型评价方法为多普勒血流仪评价[1,3-6]，但血流仪只能连续显示血流量变化情况，不能直观的显示血栓的形成特点及其变化情况。而超声可以直观地显示血栓形态，便于进行定量分析，同时可测量血栓形成过程中血流动力学变化和观察血管壁及其周围组织的解剖结构。既往夏红梅等[7]成功采用二维超声和彩色多普勒，联合评价兔腹主动脉非梗阻性动脉血栓的形成情况，同时郭朝峰等[8]采用多普勒血流仪联合超声评价兔股动脉的血栓制备，来弥补血流仪的不足。这些研究缺乏动物模型制备后是否适合溶栓的研究，也未采用超声连续监测评价血栓形成，因此本实验采用连续超声评价及造模后溶栓研究评估，简化实验方法,优化三氯化铁造模条件，试图发现更适合溶栓研究的血栓大鼠模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性(Sprague–Dawley) SD大鼠20只，体重350 g～400 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物的饲养应用均严格遵守实验室相关规定，动物实验方案经北京大学第一医院伦理委员会核准。

将20只 (Sprague–Dawley)SD大鼠按不同的三氯化铁溶液浓度随机分成四组：20%组、30%组、40%组和50%组。所有组均连续外敷大鼠单侧颈总动脉20 min，并在10、15、20 min时用超声检测血管，评价在体血栓的形成情况。

1.2 血栓动物模型制备 用5%戊巴比妥钠 (北京

韵邦生物科技有限公司)（50 mg/kg）经腹腔注射麻醉，麻醉成功后，大鼠仰卧位固定于鼠板上，于颈部正中切口，逐层钝性分离皮下肌肉及组织，分离暴露右侧颈总动脉约1 cm，并将一块0.6 cm×0.8 cm大小的透明薄膜垫在血管下方，以保护周围组织。将0.5 cm×0.5 cm大小浸泡在各个浓度三氯化铁(国药集团化学试剂有限公司)溶液中的滤纸条取出，包裹住垫好薄膜的血管。

1.3 超声评估 超声操作人员经过培训后，按照华盛顿大学医院诊断标准，在专业超声医师指导下进行图像采集。动物模型制备完成后，以iuStar130 （United Imaging）超声诊断仪，14 L探头，频率12.0 MHz，灰度46，深度2.0 cm，机械指数MI0.4探查。调整探头与血管角度，获得清晰血流信号图。在二维超声模式下，长轴切面观察颈总动脉管壁及管腔情况后，启动CDFI模式，观察管腔内彩色多普勒信号，留取储存图像。对各组颈总动脉处理前及处理后10、15、20 min图像进行分析，实验结束，获取部分实验血管行病理分析。

1.4 自通检测 超声评价最优组别进行血管再通检测，按大鼠10万U/kg体重，尾静脉给予尿激酶（南京南大药业有限公司）进行溶栓试验，30 min后，超声检测血管情况。实验结束后截取部分实验血管，甲醛固定，病理分析。

1.5 病理结果分析 对收集标本进行石蜡包埋，切片，HE染色。分别在100倍和400倍镜下观察血管腔内血栓以及血管壁的形态结构。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析计数资料采用率表示，同一组不同时间点比较采用重复测量方差分析，不同组同一时间点比较采用卡方检验。所有统计分析检验水准α= 0.05，双侧比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 三氯化铁外敷颈总动脉造模情况 50%三氯化铁浓度外敷颈总动脉20 min，血管闭塞率为100%，20%、30%组闭塞率为0，40%组闭塞率为20%（表1）。20%组，在开始外敷10 min后，血管壁开始有少量高回声，血流信号稍有改变，15 min彩色多普勒信号尚未完全消失，20 min时彩色多普勒信号消失，管腔未闭塞。30%组，在开始外敷10 min后，血管壁开始有高回声，血流信号改变明显，15 min彩色多普勒信号完全消失，管腔有附壁血栓，20 min时彩色多普勒信号消失，管腔仍未完全闭塞。40%组，在开始外敷10 min后，血管壁开始有高回声，血流信号改变明显，15 min彩色多普勒信号完全消失，管腔有附壁血栓，20 min时彩色多普勒信号消失，20%大鼠血管官腔完全闭塞。50%组，在开始外敷10 min后，血管壁开始有高回声，彩色多普勒信号完全消失，管腔有附壁血栓，15 min时候管腔变模糊，20 min时彩色多普勒信号消失，100%大鼠血管管腔闭塞（图1A）。

表1 血管闭塞情况(n=5)

2.2 120 min后血管再通及溶栓实验情况 50%组三氯化铁外敷SD大鼠颈总动脉20 min造模后，于120 min行自发再通检测和尿激酶溶栓试验，发现5只SD大鼠均没有发现自通现象（图1B），而2只（2/5）SD大鼠尾静脉注射尿激酶后发现血管部分再通（图1C）。

2.3 病理分析 50%组镜下可见动脉内膜明显损伤，结构致密(图1D)；40%组，动脉内膜损伤轻，血栓结构较松散。30%组，内膜损伤轻，血栓结构松散。20%组，动脉内膜未见明显损伤，血栓结构明显松散。2 h后自发再通检测，病理结果显示，50%血栓形态和此前无明显变化(图1E)。50%组，进行尿激酶溶栓实验后，管腔部分再通，血栓明显松散，可见淤滞红细胞(图1F)。

图1 颈总动脉彩色多普勒图像A.50%三氯化铁外敷大鼠劲总动脉20 m i n血管超声图像（箭头a,c透明薄膜两端，b为薄膜和滤纸片）；B.50%外敷20 m i n，2 h后进行自发再通检测超声图像；C.50%外敷20 m i n后，立即给予UK溶栓2 h后超声图像；D.50%外敷20 m i n血管H E染色（100×）;E.50%外敷20 m i n,2 h后血管H E染色（100×）；F.50%外敷20 m i n,给予UK溶栓2 h后H E染色（100×）

3 讨论

本研究发现，三氯化铁溶液外敷大鼠颈总动脉，闭塞性血栓的形成呈三氯化铁溶液浓度和外敷时间依赖型。即浓度越高，血栓形成越快；外敷时间越长，越易形成闭塞性血栓。50%浓度三氯化铁外敷SD大鼠颈总动脉20 min，可以形成闭塞性血栓，无自发再通现象，溶栓后可血管再通，表明该动物模型适合溶栓研究。

三氯化铁制备血栓模型存在诸多影响因素，基于不同的实验动物和目的，制备血栓模型条件没有统一的标准。三氯化铁血栓模型所涉及的实验动物包括小鼠、大鼠、兔子、猪等,涉及到的血管包括动脉、静脉及微管系统。既往研究认为根据动物的大小以及血管的状况，制备血栓所需要的浓度和时间不同[4-5,9-11]。既往动物在体溶栓研究模型多数采用三氯化铁直接外敷加超声血流仪评价血栓闭塞[6,9-10,12-14]，而缺乏采用超声评价三氯化铁制备模型的血栓闭塞和再通情况相关研究。郭朝锋等采用低浓度联合夹闭动脉，血流仪联合超声评价的方法发现，10%浓度三氯化铁溶液外敷20 min联合夹闭股动脉7 min即可成功建立股动脉血栓模型，于此相比，本研究方法更为简单易行。KWON等[15]采用血流仪检测优化三氯化铁制备大鼠颈总动脉模型发现，10%浓度和20%浓度外敷均不能形成闭塞血栓，30%浓度和40%浓度可形成闭塞血栓，但是150 min内都发生了自通现象，而50%浓度组所有大鼠都能形成闭塞血栓，连续150 min内无自发再通，且溶栓药物可以使其恢复再通，该实验，一方面与我们实验50%浓度的结果相符，即能形成闭塞血栓且无自发再通；另一方面其30%和40%可以形成闭塞血栓并未提到是在20 min时形成的，没有表明不同浓度三氯化铁外敷大鼠颈总动脉形成血栓的时间，且不能直接观测到血栓的形态和血管的解剖结构。WEI等[9]采用荧光标记血小板，活体显微镜下联合血流仪动态观测不同三氯化铁浓度作用不同时间小鼠颈总动脉血栓形成的情况，发现活体显微镜观测血栓形成比血流仪准确可靠，此方法运用了更可靠的方法，但操作更为复杂，成本更高。既往研究认为，三氯化铁外敷血管制备血栓模型是损伤动脉内膜继而引发的一系列生理病理变化[1-2]，本研究发现，浓度越高动脉内膜损伤程度更重，这可能是50%浓度组在20 min时，血管闭塞率最高的原因。

综上，采用超声连续监测评价血栓形成，简单方便，且能直接观测到血栓的形态和血管的解剖结构，更接近临床，但也存在操作水平对实验结果影响大等不足，可通过与经典的血流仪评价，以及荧光标记血小板，活体显微镜动态观测等方法联合，用于评估在体血栓制备效果。

采用50%三氯化铁浓度外敷大鼠颈总动脉20 min，可能是在体血栓模型形成的有效条件，该动物模型可能适合溶栓研究。

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Optimization of a rat model of ferric chloride-induced carotid arterial thrombosis by ultrasonic continu-ous evaluation.

TENG Yuming,JIN Haiqiang,XING Haiying,FANG Chenghe,LIU Yuanyuan,NAN Ding,SUN Yongan,HUANG Yining.Department of Neurology,Peking University First Hospital,No.8 Xishiku Street,Xicheng District,Beijing 100034,China.Tel:010-83572857.

Objective The aim of this study was to establish a reasonable protocol for a rat model of ferric chloride-induced carotid arterial thrombosis by ultrasonic continuous evaluation.Methods Twenty SD rats were randomly divided into four groups and then treated with 20%,30%,40%or 50%concentrations of FeCl3,respectively. The vascular conditions were evaluated by 14L ultrasonic probe,at 10 mins,15 mins,and 20 mins.We then selected the best group through the examination of the rate of spontaneous reperfusion of blood vessels and the rate of reperfusion after intravenous injection of urokinase.At the end of the experiment,vessels were fixed in 10%formalin solution and stained with HE.Results After external application of FeCl3 on rat common carotid artery for 20 mins,the artery occlusion rate was 100%,20%,0%and 0%in animals receiving 50%,40%,30%and 20%FeCl3,respectively.After external application of FeCl3 on rat common carotid artery for 120 mins,the spontaneous revascularization rate was 0%in 50%concentration group whereas were 100%in rest other groups(P＜0.001).In 50%concentration group,the partial recanalization rate was 40%after intravenous injection of urokinase.HE staining revealed that the thrombuswas dense and the lumen was partially recanalized after the urokinase intervention in 50%concentration group.Conclusion By use of uultrasonic continuous evaluation of ferric chloride-induced thrombosis of rat common carotid artery,we have demonstrated that external application of 50%ferric chloride solution for 20 mins is effective for the formation of thrombus model,which may be suitable for the study of thrombolysis.

animal model ferric chloride-induced thrombus Thrombus Ultrasound Evaluation

R543.4

A

2016-11-23)

(责任编辑：李立)

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.02.001

☆国家自然科学基金（编号：H0906）

* 北京大学第一医院（北京100034）