NT-3基因修饰的MSCs脑内移植对颞叶癫痫大鼠作用的研究*

王林杰， 谢 柳， 马 猛， 何 嫣， 杜展鑫， 潘晓佳， 朱晓琴△， 雷水生

1广州医科大学基础学院生理学教研室，广州 5114362湖南医药学院病理学教研室，湖南 4100063广州医科大学第二临床学院，广州 5114364广州医科大学附属第五医院皮肤美容科，广州 510700

NT-3基因修饰的MSCs脑内移植对颞叶癫痫大鼠作用的研究*

王林杰1， 谢 柳2， 马 猛1， 何 嫣1， 杜展鑫3， 潘晓佳3， 朱晓琴1△， 雷水生4△

1广州医科大学基础学院生理学教研室，广州 5114362湖南医药学院病理学教研室，湖南 4100063广州医科大学第二临床学院，广州 5114364广州医科大学附属第五医院皮肤美容科，广州 510700

目的 观察神经营养素-3(Neurotrophin 3，NT-3)基因修饰的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)脑内移植对颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy，TLE)的作用及其对大鼠海马苔藓纤维发芽(mossy fiber sprouting，MFS)的影响。方法 将构建成功的LV-GFP-NT-3转染大鼠骨髓MSCs，检测转染后MSCs内NT-3的表达；建立海人酸(Kainic acid，KA)TLE大鼠模型；将NT-3基因修饰的MSCs移植至海人酸TLE大鼠侧脑室模型后，观察其对TLE大鼠行为学、脑电图的影响，并用Timm组织化学染色法观察海马结构MFS；Western blot检测细胞移植后大鼠海马组织中NT-3的表达。结果 LV-GFP-NT-3转染细胞后，MSCs中能够正确过表达NT-3；细胞移植后NT-3-MSCs组TLE大鼠的发作次数减少，发作级别减低；脑电图结果表明TLE发作痫波减少；NT-3-MSCs组大鼠海马CA3区内分子层及始层未见到或极少见到Timm染色颗粒，Timm染色颗粒较对照组和LV-MSCs组显著减少；Western blot检测结果显示NT-3-MSCs组大鼠海马组织中NT-3含量明显增高。结论 NT-3基因修饰的MSCs脑内移植对颞叶癫痫大鼠有明显的抑制作用。

神经营养素-3； 间充质干细胞； 颞叶癫痫； 慢病毒载体

癫痫(epilepsy，EP)是由于大脑神经元突发性异常放电导致大脑功能障碍的一种慢性神经系统疾病。经正规服用抗癫痫药物，70%～80%患者的癫痫发作可得到完全控制或显著减少，但仍有20%～30%患者的癫痫难以控制，最终发展为难治性癫痫，难治性癫痫患者中有70%为颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy，TLE)。研究表明TLE发作与神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)失衡有关[1-3]。NTFs是一类对中枢和周围神经系统均有营养活性的小分子多肽或蛋白质，能支持神经细胞存活，促进其生长、发育和分化，改善神经元的病理状态。主要有神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、神经营养素-3(neurotrophin 3，NT-3)、神经营养素-4/5(neurotrophin 4/5，NT-4/5)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等[2-3]。NT-3是脑内一种重要的神经营养因子，Xu等[4]研究显示TLE发作后NT-3 mRNA表达下降，侧脑室持续灌注NT-3可抑制TLE发作，下调Trk受体，抑制海马苔藓纤维发芽(mossy fiber sprouting，MFS)，提示NT-3有防治TLE的作用。课题组前期已成功构建LV-GFP-NT-3质粒，并将含有NT-3基因的慢病毒转染间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，建立过表达NT-3的MSCs[5]。本研究将过表达NT-3的MSCs移植到TLE大鼠侧脑室，探讨NT-3基因修饰的MSCs脑内移植对TLE的作用及其对大鼠海马MFS的影响。为基因治疗TLE提供实验依据和新思路，具有一定的临床应用价值和意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

已成功构建LV-GFP-NT-3慢病毒载体[5]，使用前进行病毒滴度复核测定，得到的慢病毒浓缩液病毒滴度为2×109/mL。海人酸购于Sigma公司；RNA提取试剂盒、PCR试剂盒购于TaKaRa公司；NT-3一抗购自Abcam公司，二抗购于北京中杉金桥公司；胎牛血清FBS、低糖IMDM购于Gibco公司。实验动物：成年SD大鼠用于动物实验，体重(250±20)g，4周龄雄性SD大鼠用于培养骨髓MSCs，由广州医科大学实验动物中心提供。

1.2 实验方法及分组

1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞培养 取4周龄健康雄性SD大鼠1只，颈椎脱臼处死后置于75%乙醇中浸泡5 min，于无菌条件下取出双侧股骨、胫骨，迅速放于0.01 mol/L PBS中，剪除骨膜及软组织，切断干骺端，暴露骨髓腔，取5 mL注射器吸取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变白为止。将冲洗液反复吹打均匀，接种于60 mm培养皿，置于37℃、CO2培养箱中培养。24 h首换液、48 h全换液，以后隔天全换液，5～7 d细胞长满平皿底。细胞达到80%～90%融合时进行传代、培养。

1.2.2 海人酸TLE模型的制备及NT-3基因修饰的MSCs脑内移植 体重为(250±20)g成年SD大鼠60只，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉；将大鼠头部固定在脑立体定位仪上，备皮，消毒，纵向切开头顶部皮肤，切口长约3 cm，根据George Painos大鼠脑立体定位图谱[6-7]，确定右侧海马CA3区的三维坐标：X=-5.3 mm，Y=4.0 mm，Z=-6.0 mm，即为海马区注药点；注入海人酸1 μL(浓度为1 μg/μL，10 min注射完毕)，留针5 min。至少出现连续3次以上的惊厥发作即视为完全点燃，动物持续发作4周即可认为TLE建模成功。第5周，将成功建模的大鼠随机分为3组(每组18只)进行细胞移植：对照组，侧脑室注射生理盐水1次；LV-MSCs组，侧脑室注射MSCs 1次；NT-3-MSCs组，侧脑室注射NT-3基因修饰的MSCs 1次。分组处理时，MSCs用胰酶消化，PBS重悬制成密度为1×109/L单细胞悬液。SD大鼠称重，10%水合氯醛麻醉，固定于立体定位仪(美国Stoelting公司)上；剪毛、纵向切开大鼠头顶部皮肤，标记前囟；右侧脑室单侧注入细胞悬液30 μL，留针10 min；注射坐标：前囟后1.5 mm，旁开1.5 mm，硬膜下3.5 mm。

1.2.3 细胞移植后动物行为学观察 移植手术后视频录像观察各组大鼠癫痫的发作情况，连续观察14 d。记录各组动物癫痫的发作次数和发作级别。大鼠颞叶癫痫发作程度采用修正Racine 6级评价标准：0级，无任何发作反应；Ⅰ级，湿狗样抖动面肌痉挛，如眨眼、动须及节律性咀嚼；Ⅱ级，颈部肌肉痉挛，表现为点头和甩尾；Ⅲ级，一侧前肢阵挛；Ⅳ级，双侧前肢阵挛伴站立；Ⅴ级，全身阵挛，失去平衡，跌倒。本研究将Ⅰ～Ⅲ级定义为轻度发作；Ⅳ～Ⅴ级定义为重度发作进行观察。

1.2.4 细胞移植后动物脑电图检测 动物移植14 d后，用脑立体定位仪将脑电图记录电极送入海马深部(前囟后3.0 mm，旁开2.5 mm，硬膜下3.0 mm)，方法同侧脑室注射法。用BL-420E生物机能实验系统记录大鼠脑电图，检测癫痫发作频率。记录1 h内每只大鼠癫痫的放电频率，以出现尖波、棘波为癫痫发作的脑电波。

1.2.5 Timm组织化学染色法检测侧脑室注射NT-3-MSCs对大鼠海马MFS的影响 侧脑室细胞移植后14 d，功能实验完成后处死动物，将大鼠麻醉暴露心脏，0.4% Na2S(溶于0.01 mol/L PBS)150 mL左心室快速灌流至肝脏变色，灌注含4%多聚甲醛的2.5%戊二醛500 mL固定。取出大鼠左侧脑组织4%多聚甲醛中4℃固定过夜，用含30%蔗糖的PBS溶液(pH=7.4)浸泡包埋。用恒温冰冻切片机做背侧海马连续冠状切片，切片厚25 μm。实验前自然晾干，染色前在暗室内将0.5 mL 17%硝酸银溶液加入Timm混合液中充分混匀。倒入放好脑切片的染缸中，在密闭水浴箱内26℃下显影60～90 min，将载玻片取出用自来水冲洗10 min，终止反应，然后用双蒸水冲洗15 min，脱水、透明、中性树胶封片。

1.2.6 Western blot检测海马组织中NT-3蛋白的表达 功能实验完成后处死动物，取右侧大脑内的海马组织，加入裂解液提取总蛋白。BCA法测蛋白浓度后上样行SDS-PAGE凝胶电泳。转膜、封闭，一抗(1∶2 000)4℃孵育过夜，二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL曝光显影。用Image J分析蛋白电泳条带灰度值。

1.3 统计学方法

本实验结果均为3次以上的独立重复实验所得，实验数据均采用SPSS 18.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间数据比较采用ANOVA单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞移植后动物行为学观察

移植术后连续14 d每天固定时间观察动物的癫痫发作次数和每次发作的级别。对照组大鼠、LV-MSCs组大鼠主要表现为前后肢痉挛、站立、跌倒等癫痫发作症状，符合癫痫发作级别Ⅳ、Ⅴ级的标准，对照组癫痫发作次数平均为(2.52±1.08)次/d，LV-MSCs组癫痫发作平均为(2.27±1.09)次/d。NT-3-MSCs组大鼠主要表现为头面部肌肉痉挛、缩颈、点头的癫痫发作症状，符合癫痫发作级别Ⅰ、Ⅱ级标准，癫痫发作次数平均为(1.51±1.10)次/d。

2.2 细胞移植后动物脑电图检测

细胞侧脑室移植术后14 d，行脑电图检测同一时间内各组动物的脑电波，检测时间为1 h。结果如图1：NT-3-MSCs组大鼠癫痫发作的痫波——尖波、棘波减少，平均波幅为(50.00±2.00)μV，而对照组和NT-3-MSCs组大鼠仍有较多痫波出现，对照组平均波幅为(178.33±7.63)μV，LV-MSCs组平均波幅为(177.00±8.18)μV。各组总波幅比较：NT-3-MSCs组波幅较对照组和LV-MSCs组均显著降低(均P<0.05)；对照组与LV-MSCs组相比，差异无统计学意义。

2.3 Western blot检测脑组织中NT-3表达

侧脑室细胞移植后第14天处死动物取脑组织，Western blot检测脑海马组织NT-3的表达。结果显示(图2)，对照组、LV-MSCs组、NT-3-MSCs组NT-3蛋白相对表达量分别为(0.75±0.13)、(0.67±0.12)、(2.37±0.15)。LV-GFP-NT-3转染MSCs移植后海马中NT-3含量高于对照组和LV-MSCs组(均P<0.05)，而对照组和LV-MSCs组之间差异无统计学意义。

A：脑电图癫痫发作波；B：癫痫发作波波幅；与对照组比较，*P<0.05；与LV-MSCs组比较，#P<0.05图1 脑电图检测癫痫发作波及波幅Fig.1 EEG of epileptic seizures and the amplitudes of spike-and-wave discharges

与对照组比较，*P<0.05；与LV-MSCs组比较，#P<0.05图2 Western blot检测大鼠海马组织NT-3的表达Fig.2 Western blot analysis of the expression of NT-3 in the rat hippocampal tissues

2.4 Timm组织化学染色法检测侧脑室注射NT-3-MSCs对大鼠海马MFS的影响

用Timm组织化学染色方法标记苔纤维富含锌的突触末端。侧脑室细胞移植后14 d，经Timm银染后用光镜观察MFS及突触重建。对照组和LV-MSCs组大鼠海马CA3区均可见到不同程度的Timm染色颗粒，NT-3-MSCs组大鼠海马CA3区内分子层及始层未见到或极少见到Timm染色颗粒(图3)。

A：对照组；B：LV-MSCs组；C：NT-3-MSCs组；箭头所指为染色阳性颗粒图3 细胞侧脑室移植后海马CA3区MFS情况(Timm染色，×40)Fig.3 MFS of the hippocampal CA3 region after lateral ventricle transplantation of NT-3-MSCs(Timm staining，×40)

3 讨论

MSCs是一类功能齐全的干细胞，是骨髓中除造血干细胞外的另外一种干细胞[8]。大量研究表明，MSCs是细胞移植理想的种子细胞，但是骨髓中MSCs的含量很少，如果要将MSCs应用到临床治疗疾病，则必须要对MSCs进行体外分离培养和扩增[9-11]。目前对于干细胞的培养方法有4种：全骨髓贴壁法、流式细胞仪分选法、密度梯度离心法和免疫磁珠筛选。密度离心法可以获得相对比较纯化的MSCs，但是密度离心法在离心的过程中会对MSCs的活性产生影响，并且会损失一定数量的MSCs；流式细胞仪分选法、免疫磁珠分选法使用的仪器和试剂昂贵、操作复杂，并且通过这种方法分选的细胞的活性会受到影响；而全骨髓贴壁法具有操作简单、经济、对细胞损伤小等优点，而被广泛应用。本课题组前期通过全骨髓贴壁法成功地分离培养了MSCs，并诱导MSCs分化为成脂肪细胞，说明MSCs具有多向分化潜能。本课题组培养的MSCs与国内外报道的MSCs的特征基本一致[12]，为本实验提供了细胞移植的基础材料。

近来，科研工作者发现了以HIV为基础构建的慢病毒载体[13]。该类载体具有以下优点：①转染细胞种类多，不仅可以转染分裂细胞，还可以转染非分裂细胞；②受体对该病毒载体系统的免疫反应小；③转染率高，可反复转染同一细胞，转染基因片段容量大，它可以把基因整合到目的细胞内，使目的基因长期表达且安全性高。本实验应用的慢病毒载体是以国际通用的第3代载体系统为基础，通过改建构成的三质粒系统，慢病毒载体删除了全部HIV-1的编码基因，应用安全稳定。用包装产生的高滴度的病毒液转染MSCs，转染效率高。为了检测NT-3是否成功转染MSCs，我们以β-actin为内参，通过Western blot检测LV-GFP-NT-3蛋白的表达，结果显示：NT-3-MSCs组在29 kD附近有特异性条带，而对照组未检测到NT-3蛋白的表达，由此可判断NT-3可以在MSCs中表达，从而为本实验基因体内转染治疗TLE提供了表达NT-3的细胞株。

NT-3是神经营养素家族中重要的成员，它在神经系统发育、中枢神经元的保护、周围神经再生及营养肌肉阻止轴突和运动终板退变等方面均发挥着重要的生物学作用，具有较为广泛的生物活性[14-16]。NT-3的受体是TrkC，NT-3同TrkC结合后可迅速启动一系列包括TrkA、TrkC和磷脂酶C在内的信号途径，这些信号途径对于神经元自身的信号分子如离子通道和神经递质受体的表达和功能状态具有调节作用。

本实验向癫痫大鼠脑内移植NT-3基因修饰的MSCs，在移植术后14 d，Western blot检测结果显示NT-3-MSCs组NT-3蛋白表达量高于LV-MSCs组和对照组，说明移植LV-GFP-NT-3细胞可以存活，并能在较短时间内产生高浓度的NT-3。脑电图是目前监测TLE发作时神经元兴奋性的客观指标。本实验将LV-GFP-NT-3移植大鼠14 d后，脑电图结果显示NT-3-MSCs组癫痫发作波波幅较LV-MSCs组和对照组明显降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)。可见，NT-3-MSCs细胞移植对TLE有缓解作用。这个现象说明细胞移植LV-GFP-NT-3产生的NT-3在移植14 d即能发挥作用，起到抗TLE的效应。2002年Xu等[4]用流量调节渗透性微型泵将小剂量NT-3持续注入电点燃的TLE大鼠侧脑室，连续注射14 d后发现齿状回MFS现象减少，TLE发作次数减少，与本实验结果一致。本实验在侧脑室细胞移植术后通过视频记录并观察各组动物TLE发作情况，结果显示NT-3-MSCs组癫痫大鼠发作次数发作级别明显小于LV-MSCs组和对照组。

苔藓纤维是海马齿状回颗粒细胞的轴突与CA3区神经元之间有突触联系[17]。正常情况下，苔藓纤维与CA3区神经元形成突触联系。致痫药物注射后，先引起CA3区神经元的凋亡，随后才引起MFS，形成回返性突触联系自体兴奋，Okazaki等[18]认为这种回返性突触联系可使癫痫的阈值下降。海马神经元凋亡是MFS的原因，而MFS可能是颗粒细胞兴奋性增高的原因。本研究将经过Timm银染后的大鼠海马脑片置于显微镜下观察，发现侧脑室细胞移植14 d后，NT-3-MSCs组大鼠海马CA3区内分子层及始层未见到或极少见到Timm染色颗粒，表明NT-3-MSCs侧脑室移植后对TLE后MFS及兴奋性环路重建具有抑制作用。

我们推测本研究中NT-3-MSCs移植抑制TLE的可能机制为：①NT-3下调TrkA受体，抑制NGF与TrkA结合，减少胞质内酪氨酸蛋白激酶的磷酸化，抑制了PKC、PI3K/AKT、Ras/MAPK等信号通路，从而减少了MFS，进而有效抑制癫痫发作波的出现；②补充了齿状回门区和海马CA3区神经元的丢失，为苔藓纤维投射提供了靶细胞；③移植的MSCs能够产生如NGF等神经营养因子，这些神经营养因子一方面作为苔藓纤维的趋化因子诱导其向齿状回门区和海马CA3区生长，另一方面抑制了CA3区细胞的进一步缺失。

本研究将NT-3基因修饰的MSCs脑内移植。外源性补充NT-3抑制了海马MFS，改善了颞叶癫痫灶的组织结构，表明NT-3对致痫后兴奋性神经环路重建有抑制作用。对于移植细胞在脑内的迁移分布和细胞移植后的远期疗效及其确切的作用机制，本课题组将会在后续研究中进行深入探讨。

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(2016-11-07 收稿)

Effects of Intracerebral Transplantation of NT-3-modified MesenchymalStem Cells on Temporal Lobe Epilepsy in Rats

Wang Linjie1，Xie Liu2，Ma Meng1etal

1SchoolofBasicSciences，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou511436，China2HunanUniversityofMedicine，Hunan410006，China

Objective To examine the expression of NT-3-transfected mesenchymal stem cells(MSCs)in the brain of rats with temporal lobe epilepsy(TLE)and to explore the effect of such expression on TLE.Methods Lentivirus(LV)vectors containing NT-3 gene were constructed，and they were later transfected into rat bone marrow MSCs.The expression levels of NT-3 gene were detected in MSCs.The TLE model was established in rats induced by kainic acid(KA).Thereafter，the NT-3-modified MSCs were transplanted into the lateral ventricle of TLE models.The effects of NT-3-modified MSCs on the behaviors of TLE rats，and EEG were obserued and the hippocampal mossy fiber sprouting wars measured by Timm histochemical staining.Western blotting was used to detect the NT-3 expression.Results Transfection of LV-GFP-NT-3 cells could leael to the over-expression of NT-3 in MSCs.After transplantation with NT-3-MSCs，the number of seizures and attacks were found to be reduced.EEG results showed the epileptic seizure waves were reduced，and Timm histochemical staining showed less of hippocampal mossy fiber sprouting.Timm staining particles were significantly reduced in NT-3-modified MSCs-transplanted rats as compared with those in the control group and the LV-MSCs group.Western blot analysis showed that in hippocampal tissues NT-3 was significantly increased in NT-3-MSCs group.Conclusion NT-3 gene-modified MSCs transplantation can significantly reduce the seizures in rats with TLE.

Neurotrophin-3； mesenchymal stem cells； temporal lobe epilepsy； lentiviral vector

*广东省省级科技计划项目(No.2014A020212512，No.2013B021800191)；广州市属高校科研计划项目(No.2012C128，No.2012D001)；2017年大学生科技创新培育专项资金资助项目(No.pdjh2017b0417)

R742.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.02.013

王林杰，女，1992年生，硕士研究生，E-mail：wlj511.love@163.com

△Corresponding author，E-mail：whzhuxiaoqin@163.com(朱晓琴)，Leishuisheng@126.com(雷水生)