乙肝病毒血清标志物与HBV DNA载量及肝功能指标的关联性

王 斌， 黄汉菊

1华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，武汉 430030 2华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系，武汉 430030

乙肝病毒血清标志物与HBV DNA载量及肝功能指标的关联性

王 斌1， 黄汉菊2

1华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，武汉 4300302华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系，武汉 430030

目的 探讨外周血中乙肝病毒血清标志物(hepatitis B virus serum markers，HBV-M)、HBV DNA载量和反映肝损伤的肝功能指标之间的关联性。方法 回顾分析2014年3月～2016年3月同济医院483例慢性乙型肝炎患者资料，HBV-M采用微粒子化学发光技术定量检测；HBV DNA采用实时荧光定量PCR检测；谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)采用紫外连续监测法检测。结果 HBsAg的含量与HBV DNA载量、ALT异常比例(>41 U/L)和AST异常比例(>35 U/L)之间均无关联性(均P>0.05)；HBeAg的含量与HBV DNA载量和ALT异常比例之间均无关联性(均P>0.05)，但与AST异常比例有关联，关联程度不密切(r=0.21，P<0.01)；抗-HBe的含量与HBV DNA载量和AST异常比例之间有关联性，但关联程度不密切(r=0.16，P<0.05；r=0.19，P<0.01)，与ALT异常比例之间无关联性(P>0.05)；抗-HBc的含量与HBV DNA载量、ALT异常比例和AST异常比例之间均有关联性，但关联程度不密切(r=0.25，P<0.01；r=0.29，P<0.01；r=0.29，P<0.01)；HBV DNA载量的对数值与ALT和AST呈正相关，但线性相关程度较弱(r=0.24；r=0.29)。结论 乙肝病毒血清标志物定量检测和HBV DNA定量检测，二者相互补充但不能取代，同时联合肝功能各项指标的检测，更有助于了解肝组织的受损程度。

乙型肝炎病毒； 乙肝病毒血清标志物； HBV DNA； 谷丙转氨酶； 谷草转氨酶

全球约有1/3的人感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)[1]，每年约有65万人死于HBV感染所致的相关疾病[2]。我国属乙肝高流行区，由于国家对该疾病的高度重视，广泛普及乙肝疫苗的免疫，近年来急性HBV感染明显减少，乙肝e抗原(HBeAg)阴性的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的比例有所上升[3]。

乙肝病毒血清标志物(hepatitis B virus serum markers，HBV-M)包括：乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体(抗-HBs)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗体(抗-HBe)和乙肝核心抗体(抗-HBc)。目前，多数文献仅从HBV-M的定性结果或单一抗原定量结果来分析其与HBV DNA的关系，同时在研究HBV DNA载量与肝功能指标的关系方面，文献报道缺乏一致性。本文将从以下2个方面进行分析：①HBV-M定量与HBV DNA载量和肝功能指标[谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)]之间的关系，②HBV DNA载量与肝功能指标之间的关系。旨在为乙型肝炎的临床诊断、疗效监测和预后判断提供更多有价值的实验室支持，同时提高实验室日常工作质量和工作效率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 回顾分析我院2014年3月～2016年3月收治的483例慢性乙型肝炎患者资料(符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》对慢性乙型肝炎的诊断标准[3]，并排除甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎)，其中男273例，女210例，男∶女比例=1.3∶1，年龄17～79岁，平均年龄(41.0±13.4)岁。

1.1.2 主要仪器 高速台式冷冻离心机(美国Thermo，MicroCL 21R)；恒温金属浴(杭州大和热磁电子有限公司，HB100)；荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司，LightCycler 480)；生物安全柜(美国Thermo Forma，ClassⅡA/B3)；免疫检测系统(美国Beckman公司，Immage 800)；酶标仪(澳大利亚TECAN，freedom evolyzer150-8)；全自动生化分析仪(瑞士Roche公司，cobas 8000)。

1.1.3 试剂 乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒(深圳市凯杰生物工程股份有限公司)；乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测的室内质控品(北京康彻斯坦生物技术有限公司)；乙型肝炎病毒抗原抗体诊断试剂盒(美国雅培制药有限公司)；AST和ALT试剂盒(罗氏制药有限公司)。

1.1.4 实验室和人员资格 2003年我院检验科PCR实验室获得卫生部临检中心颁发的实验室验收合格证书，从事PCR操作的人员均取得卫生部或省临检中心颁发的上岗证书。

1.2 实验方法

1.2.1 样本采集 清晨空腹条件下抽取肘静脉血10 mL，分别置肝素钠真空抗凝管(3 mL，检测ALT和AST)、无菌真空管(3 mL，定量检测HBV-M)、无菌真空管(2 mL，定量检测HBV DNA)。3 000 r/min离心15 min，取血浆或血清当天检测；如当天不能检测的HBV DNA标本，将分离后的血清置-20℃冻存待检。

1.2.2 血清中HBV DNA的检测 采用实时荧光定量PCR法。该方法是目前临床检测血清中HBV DNA常用的分子生物学方法。严格按试剂盒说明书进行操作。试剂盒灵敏度为：5.0×102copies/mL，定量检测线性范围：1.0×103～5.0×107(copies/mL)。

1.2.3 HBV-M定量检测 采用微粒子化学发光检测技术。

1.2.4 ALT和AST的检测 采用国际临床化学学会(IFCC)推荐的紫外连续监测法。

1.3 统计学方法

所有数据利用SPSS 11.5建立数据库，进行统计学分析。计数资料组间比较采用χ2检验，计量资料组间均数比较采用t检验和线性相关分析。

2 结果

2.1 HBV-M检出模式

将HBsAg设定为1、抗-HBs为2、HBeAg为3、抗-HBe为4、抗-HBc为5，483份血清标本HBV-M的检测结果有11种模式，其中1.4.5模式检出率最高(57.35%)，其次为1.3.5模式(20.29%)，这两组模式的检出率经χ2检验显示差异有统计学意义(P<0.01)，其它各模式的检出率不到10 %。55份HBsAg阴性血清中(2.4.5、2.5、2、4.5、5及全阴模式的血清)均未检测到HBV DNA，所以后续分析的结果均来源于428份HBsAg阳性血清(1.4.5、1.3.5、1.5、1.3.4.5和1.2.4.5模式的血清)。HBV-M的11种检出模式见表1。

2.2 HBV-M定量与HBV DNA载量及肝功能指标的关系

2.2.1 HBsAg含量与HBV DNA载量及ALT、AST的关系 将HBV DNA载量分为3组(单位：copies/mL)：<103为低载量组，103～105为中载量组，>105为高载量组。HBsAg阳性(≥0.05 U/mL)时的含量分为4组(单位：U/mL)：0.05～、10～、100～和250～。经统计学分析后发现：HBsAg阳性时的含量与HBV DNA载量、ALT异常比例(>41 U/L)和AST异常比例(>35 U/L)之间均无关联性(χ2=3.59，P>0.05；χ2=0.51，P>0.05；χ2=0.87，P>0.05)。见表2和表6。

2.2.2 抗-HBs含量与HBV DNA载量及ALT、AST的关系 因HBsAg阳性血清中含有抗-HBs的只有1.2.4.5模式(4例)，例数太少，所以未行统计分析。

2.2.3 HBeAg含量与HBV DNA载量及ALT、AST的关系 将HBeAg阳性(≥1.0 S/CO)时的含量分为3组(单位：S/CO)：1.0～、100～和1 000～。每组均以检出高载量的HBV DNA为主。经统计学分析后发现：HBeAg阳性时的含量与HBV DNA载量和ALT异常比例之间无关联性(χ2=4.68，P>0.05；χ2=2.09，P>0.05)，但与AST异常比例有关联性(χ2=10.60，P<0.01)，关联程度不密切(r=0.21)，HBeAg含量在100 S/CO～时，AST异常的比例较高。见表3和表6。

表1 483份血清标本的HBV-M检出模式

表2 HBsAg含量与HBV DNA载量和肝功能的关系[例(%)]

表3 HBeAg含量与HBV DNA载量和肝功能的关系[例(%)]

2.2.4 抗-HBe含量与HBV DNA载量及ALT、AST的关系 将抗-HBe阳性(≤1 S/CO)时的含量分为2组(单位：S/CO)：<0.1和≥0.1。抗-HBe阳性时，HBV DNA以低、中载量检出为主(85.31%,244/286)。经统计学分析后发现：抗-HBe阳性时的含量与HBV DNA载量和AST异常比例之间有关联性(χ2=7.95，P<0.05；χ2=10.33，P<0.01)，但关联程度不密切(r=0.16；r=0.19)；与ALT异常比例无关联性(P>0.05)。见表4和表6。

表4 抗-HBe含量与HBV DNA载量和肝功能的关系[例(%)]

2.2.5 抗-HBc含量与HBV DNA载量及ALT、AST的关系 将抗-HBc阳性(≥1 S/CO)时的含量按从低到高的顺序分为3组(单位：S/CO)：1.0～、10～、20～。1.0～组，HBV DNA以低载量检出为主(58.70%)，与中、高载量组检出率之间的差异有统计学意义(χ2=10.50，P<0.01)；10～组，HBV DNA 3个载量组之间的检出率差异无统计学意义(χ2=5.81，P>0.05)；20～组，HBV DNA以高载量检出为主(59.09%)，与低、中载量组检出率之间的差异有统计学意义(χ2=22.06，P<0.01)，该组的ALT异常比例和AST异常比例明显高于1.0～组和10～组(χ2=23.42，P<0.01；χ2=22.46，P<0.01)。

总之，抗-HBc阳性时的含量与HBV DNA载量、ALT异常比例和AST异常比例之间有关联性(χ2=31.86，P<0.01；χ2=36.38，P<0.01；χ2=35.55，P<0.01)，但关联程度不密切(r=0.25；r=0.29；r=0.29)。见表5和表6。

表5 抗-HBc含量与HBV DNA载量和肝功能的关系

表6 HBV-M定量与HBV DNA载量和肝功能的关联性

2.3 HBV DNA载量与肝功能指标的关系

取HBV DNA载量的对数值(the logarithm of HBV DNA load，lg HBV DNA)与ALT、AST数据进行线性相关分析，结果发现ALT和AST与HBV DNA载量的对数呈正相关，但线性相关程度较弱(r=0.24，r=0.29)。见图1和图2。

图1 ALT与lg HBV DNA的相关性分析(r=0.24，P<0.01)Fig.1 Correlation between ALT and lg HBV DNA(r=0.24，P<0.01)

2.4 HBV-M定性与HBV DNA的关系

2.4.1 HBeAg与HBV DNA检出率之间的关系 HBV复制的指标常用的有HBV DNA和HBeAg。在HBsAg阳性血清中，HBV DNA和HBeAg检出率依次为67.99%和24.07%，HBV DNA检出率比HBeAg的检出率高，二者差异有统计学意义(χ2=178.51，P<0.01)。

图2 AST与lg HBV DNA的相关性分析(r=0.29，P<0.01)Fig.2 Correlation between AST and lg HBV DNA(r=0.29，P<0.01)

以HBV DNA的检出作为HBV复制的金标准来评价HBeAg：HBeAg检测灵敏度为33.68%、特异度为96.35%、阳性预测值为95.15%、阴性预测值为40.62%。见表7。

表7 HBeAg检出率与HBV DNA检出率的关系

2.4.2 HBeAg定性与HBV DNA载量的关系 根据HBsAg阳性血清中是否含有HBeAg，将HBsAg阳性血清分为2组：HBeAg阴性组和HBeAg阳性组。HBeAg阴性组，HBV DNA以低载量检出为主(46.77%)，经χ2检验显示与中、高载量组之间的检出率差异有统计学意义(均P<0.01)；HBeAg阳性组，HBV DNA以高载量检出为主(76.70%)，经χ2检验显示与低、中载量组之间检出率的差异有统计学意义(均P<0.01)，见表8。

表8 HBeAg定性与HBV DNA载量的关系[例(%)]

3 讨论

3.1 HBV-M定量、HBV DNA载量和肝功能三者的关系

慢性乙肝患者，特别是HBeAg某些前核或基本核心启动子区域存在变异的患者，因无法用HBV DNA载量的高低来解释HBeAg的缺失，所以转向对HBsAg含量与HBV DNA载量之间关系的研究逐渐增多。本文的研究数据显示：428例HBsAg阳性血清中HBV DNA阳性的有291例，HBsAg含量与HBV DNA载量之间无关联性(P>0.05)，与有些早期文献报道[4-6]一致，而近期的文献报道认为：HBsAg含量与HBV DNA载量之间有良好的相关性，动态监测HBsAg含量对乙肝的治疗有一定指导意义，可作为监测抗HBV疗效的替代标记[7-8]。本研究与近期的文献报道存在差异的原因，可能是进行数据收集时，未将慢性乙肝患者按病程的不同阶段进行统计分析造成的，这也是后续需要进一步研究探讨的地方。

表5和表6提示抗-HBc高含量时病毒复制活跃，而低含量则表示曾感染过乙肝病毒，只具有流行病学意义。当抗-HBc含量逐渐增加时，ALT和AST的异常比例也逐步升高。可能是由于抗-HBc与位于肝细胞表面的HBcAg一起参与诱导T淋巴细胞对肝细胞的细胞毒作用，造成肝细胞的免疫病理损伤，所以监测抗-HBc含量变化可以十分敏感地反映肝细胞是否损伤，其临床价值甚至超过ALT[9]，但这方面鲜有文献报道。

在HBV DNA载量与肝功能的关系上，各种报道缺乏一致性。在未区分乙肝感染类型及感染程度的前提下，本研究得出的结论是：HBV DNA载量的对数值与反映肝实质损伤的ALT、AST呈正相关，但线性相关程度较弱(r=0.24，P<0.01；r=0.29，P<0.01)，与某些报道一致[10]。目前关于HBV感染与肝细胞损伤之间的关系有以下几种观点：①肝细胞表面HBV抗原可引起人体的细胞免疫和体液免疫应答，是造成肝细胞损伤的重要原因和主要机制；②病毒大量复制造成其中间产物在细胞内累积引发肝细胞损伤[11]；③HBV感染早期机体处于免疫耐受阶段时，尽管体内病毒复制活跃，但肝组织却可以正常或接近正常；④有些乙肝患者在服药治疗期间，HBV复制不是很活跃，但会出现因病情和个体差异造成的药物性肝损害。

HBV-M定量检测能够提供乙肝病毒血清标志物的精确浓度，在一定范围内可减少对乙型肝炎的漏诊和误诊，虽然检测费用较高，但它产生的临床价值和社会效应远远超过定性检测，因此HBV-M定量检测会逐渐被人们所认识和接受，以弥补定性检测的不足，而且HBV-M定量与HBV DNA荧光定量检测相互补充，在综合评价患者病情和观察药物疗效上会有更大帮助。同时，外周血HBV DNA载量的高低可以直接反映HBV在血液中的复制情况，较为准确地判断感染后的传染性，但是不能完全反映肝损伤状态，因此在检测病毒载量的同时检测肝功能各项指标，以便直接了解肝组织的受损程度，为临床提供重要依据。

3.2 关于HBeAg阴性并HBV DNA阳性及HBeAg阳性并HBV DNA阴性的结果分析

本文中有193例HBeAg阴性而HBV DNA阳性的血清标本，分析原因有以下几种可能：①患者感染了不表达HBeAg的HBV突变株。亚洲、非洲和南欧的慢性乙肝患者体内HBV前C区突变率达47%～60%[12]，我国HBV突变最常见位点是前C区G1896→A变异[13]，由于TAG为终止密码子，不能编码HBeAg C区启动子A1762→T和G1764→A的双变异，使前C区mRNA的产生减少，导致HBeAg产量减少，但不影响病毒复制。②乙肝患者处于感染初期或恢复期，外周血中HBeAg浓度较低。③常规检测方法灵敏度不够高，不能测出较低含量的HBeAg。

本文中有137例HBV DNA阴性的血清标本，检出5例HBeAg阳性的情况，排除操作过程造成的核酸假阴性，考虑可能的原因有：①HBV DNA整合到患者肝细胞染色体中或者HBV只在肝细胞内复制，致使外周血中HBV DNA载量很低甚至低于检测下限。研究显示[14]，慢性HBV感染者的肝细胞基因组中可发现整合的HBV DNA，整合概率随着感染的病程延长和病情加重而增加，导致外周血中HBV DNA载量减少，HBV检出率下降。另有报道[15]，肝细胞内HBV DNA的检出率明显高于外周血，当HBV DNA在外周血中呈阴性时，其在肝细胞内仍处于一定水平。②HBeAg是一种蛋白质，蛋白质的半衰期比DNA的长，某些乙肝患者通过抗病毒治疗后或者机体处于非活动期时，此时病毒复制受到抑制[16]。③与HBV变异有关。在PCR扩增反应中，如果与引物碱基配对的HBV DNA序列发生变异，引物就不能正常结合到模板DNA上，导致整个PCR扩增反应无法正常启动，出现假阴性结果。作为实验室工作人员，如果遇到HBeAg阳性而HBV DNA阴性的标本，可换用含有不同引物的试剂盒来复查外周血HBV DNA，必要时可检测肝细胞内HBV DNA；作为临床医生，应根据患者的具体临床表现和其它各项检测指标进行综合判断。

总之，HBV复制的这二项指标(HBeAg和HBV DNA)存在着交叉阳性和交叉阴性，在实际工作中可协同检测，相互补充，减少漏检概率。

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(2016-11-09 收稿)

Correlations of Serum Markers of Hepatitis B Virus，HBV DNA Load and Liver Function

Wang Bin1，Huang Hanju2

1DepartmentofLaboratoryMedicine，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofMedicalMicrobiology，SchoolofBasicMedicine，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To investigate the correlations of serum markers of hepatitis B virus，HBV DNA load and liver function indexes[alanine aminotransferase(ALT)and aspartate transaminase(AST)]in the peripheral blood.Methods Clinical data of 483 patients who were diagnosed with chronic hepatitis B and treated between March 2014 and March 2016 in Tongji hospital were retrospectively analyzed.The serum markers of hepatitis B virus were quantitatively detected by chemiluminescent microparticle immunoassay.Serum HBV DNA load was measured by real-time fluorescence quantitative PCR，and ALT and AST by continuous ultraviolet monitoring.Results There was no correlation between the HBsAg content and HBV DNA load or the rates of abnormal ALT(>41 U/L)and abnormal AST(>35 U/L)(P>0.05).The HBeAg content was not correlated with HBV DNA load and the rates of abnormal ALT(P>0.05)，but weakly with the rate of abnormal AST(r=0.21，P<0.01).Although the anti-HBe content was not correlated with the rate of abnormal ALT(P>0.05)，it was weakly related to HBV DNA load and the rates of abnormal AST(r=0.16，P<0.05；r=0.19，P<0.01).The anti-HBc content had weak correlations with HBV DNA load，the rates of abnormal ALT and abnormal AST(r=0.25，P<0.01；r=0.29，P<0.01；r=0.29，P<0.01).The logarithm value of HBV DNA load was weakly positively correlated with ALT and AST(r=0.24；r=0.29).Conclusion Quantitative detection of both serum markers and the DNA of hepatitis B virus can complement each other，and when combined with detection of liver function indexes，it will help understand the damage of liver tissue.

hepatitis B virus； serum markers of hepatitis B virus； HBV DNA； alanine aminotransferase； aspartate transaminase

R446.62

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.02.020

王 斌，女，1972年生，主管技师，E-mail：fanzihua2010@163.com