甲状旁腺素通过调控初级纤毛的表达促进软骨肉瘤细胞增殖和侵袭*

许 凯， 向 威， 成薇婷

1华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉 4300302华中科技大学同济医学院附属武汉中西医结合医院肿瘤科，武汉 430022

甲状旁腺素通过调控初级纤毛的表达促进软骨肉瘤细胞增殖和侵袭*

许 凯1#， 向 威1#， 成薇婷2△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉 4300302华中科技大学同济医学院附属武汉中西医结合医院肿瘤科，武汉 430022

目的 探究甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)对软骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的影响，及其与初始纤毛表达调控之间的相互关系。方法 应用不同浓度PTH刺激软骨肉瘤细胞SW1353，缺氧诱导纤毛表达和水合氯醛破坏纤毛结构后，通过CCK8细胞活性实验，Western blot及Transwell实验检测SW1353细胞的增殖和侵袭能力，免疫荧光计数初始纤毛表达情况，荧光定量PCR检测相关目的基因GLI1、PTCH1和IFT88的表达情况。结果 PTH能促进软骨肉瘤细胞增殖，且呈浓度依赖性，其促增殖效应与纤毛结构的完整性有关；PTH能上调SW1353细胞的侵袭能力，增加基质金属蛋白酶MMP9的表达，破坏纤毛结构后，PTH促进软骨肉瘤的侵袭效应受到抑制；PTH下调SW1353细胞初始纤毛的数量，其效应与纤毛结构完整性有关；PTH能调控Hedgehog通路靶基因GLI1、PTCH1及纤毛功能相关基因IFT88的表达。结论 PTH能促进软骨肉瘤细胞的增殖和侵袭，同时抑制软骨肉瘤细胞初级纤毛的表达并影响其下游靶基因表达，PTH可能通过作用于初始纤毛来调控软骨肉瘤的恶性生物学特性。

甲状旁腺素； 人软骨肉瘤； 增殖； 侵袭； 初始纤毛

软骨肉瘤是以分泌软骨样基质为特征的恶性骨肿瘤，其增殖和侵袭等恶性生物学特性与其分化程度有关，常好发于20岁以上青壮年，10年生存率波动于29%到83%之间。由于软骨肉瘤组织中缺乏血管并分泌有致密的软骨样基质保护，软骨肉瘤对常规化疗和放疗均不敏感，手术切除是目前主流的治疗方法[1-2]。因此，对软骨肉瘤恶性生物学进程的机制研究，将为明确肿瘤发病机制及开发新的治疗方法提供重要的依据。

甲状旁腺素(PTH)是通过调节体内钙平衡来影响骨和软骨生长发育的重要信号因子[3]。在正常软骨发育过程中，内源性甲状旁腺素相关肽PTHrP与刺猬蛋白(Hedgehog，Hh)构成的PTHrP /Hedgehog负反馈环路发挥重要作用。Ihh蛋白促进PTH分泌表达，使细胞保持增殖状态，反之PTH则抑制Ihh蛋白的表达，阻止细胞向肥大方向分化，这种负反馈环路有助于调控软骨细胞的成熟和推迟软骨内骨化，从而有助于维持正常的结构和功能[4]。

然而，在某些肿瘤中通常可以检测到异常表达的PTH，如骨巨细胞瘤及各种骨转移瘤，这些肿瘤常伴随溶骨性破坏及高钙血症，影响骨与软骨的结构和功能[5-6]。初始纤毛作为一种具有感受器功能的细胞膜表面结构，参与多种细胞生命活动过程。初始纤毛能感受细胞微环境中的物理及化学刺激，参与多种信号通路的传递过程，如Hedgehog和Wnt信号通路等[7]。此外，初始纤毛的重构还是细胞有丝分裂结束的重要标志[8]。很多研究已经证明：初始纤毛功能紊乱与肿瘤发生密切联系，如胃肠肿瘤、乳腺癌等[9-10]，因此，探究初始纤毛在软骨肉瘤中的表达情况及对PTH信号调控作用的影响将为明确软骨肉瘤的发生机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人软骨肉瘤细胞系SW1353购自上海中国科学院细胞库，细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的DMEM/F-12培养液中，于37℃、5% CO2环境中培养。人重组PTH(1-84)购买于Prospec公司。应用5～200 nmol/L的重组人PTH(1-84)作用SW1353细胞24 h，分为对照组和不同浓度梯度PTH干预组，并确定PTH的最佳干预浓度。通过使用无血清培养液饥饿细胞6 h以诱导初始纤毛表达或加入40 μmol/L水合氯醛破坏纤毛与基底部的连接而抑制纤毛形成，分为纤毛诱导组和纤毛解构组，再分别加入最佳浓度的PTH进行干预。

1.2 细胞增殖实验

通过CCK8细胞活性实验检测PTH对软骨肉瘤细胞SW1353增殖能力的影响。首先以2 000个/孔的细胞密度将细胞接种于96孔板中，每组设置5个复孔，加入相应干预试剂，并在100 μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中进行适当时间培养。然后在每孔中加入10 μL的CCK8试剂(武汉博士德公司)，37℃培养箱中孵育2 h后用酶标仪检测450 nm波长下的吸光度(A)值，细胞活力用A值表示。

1.3 Transwell侵袭实验

通过运用Transwell肿瘤侵袭实验来评估软骨肉瘤细胞的侵袭能力。在Transwell小室内膜(孔径为8 μm)上均匀涂布30 μL的基质胶(与培养液以1∶4稀释)并在37℃下孵育30 min以凝固，下部腔室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM/F-12细胞培养液。先将SW1353细胞在无血清培养液中饥饿6 h，消化后以1×105个/mL的细胞密度将200 μL细胞悬液转移到小室上部。根据不同分组，分别加入100 nmol/L的PTH及40 μL的水合氯醛对细胞进行干预。24 h后，棉签轻轻拭去上层基质胶，4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS清洗3遍后行结晶紫染色。随机选择10个视野在显微镜下进行细胞计数。

1.4 免疫荧光实验

适当密度的软骨肉瘤SW1353细胞接种在盖玻片上，经不同干预刺激24 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.5%BSA在室温下封闭60 min，然后用小鼠来源的乙酰化α微管蛋白抗体(1：300，Abcam公司)在4℃下孵育过夜。PBS洗涤3遍后用CY3标记的山羊抗小鼠荧光二抗在室温下孵育1 h，再用1 μg/μL DAPI进行细胞核染色，PBS洗涤3遍后用荧光显微镜观察实验结果。

1.5 Western blot实验

提取细胞总蛋白，制备上样缓冲液，以每孔20 μg蛋白上样进行电泳分离，湿转膜法转移到硝酸纤维素膜上，5% BSA封闭1 h，用MMP9抗体(1：1 000，Cell Signaling Technology公司)和β-actin抗体(1：400，博士德公司)4℃孵育过夜，洗膜3次后用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗(1∶5 000，博士德公司)孵育1 h，常规洗膜，ECL荧光显色系统暗室成像。

1.6 实时定量PCR

用Trizol法提取细胞总RNA，再通过RT-PCR试剂盒(Invitrogen公司)合成2～5 μg cDNA。全套PCR系统包含cDNA、SYBR Green、无RNA酶、水和引物。引物序列为：hβ-actin，5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，5′-CTCCTTAATGTCAC-GCACGAT3′；hPTCH1，5′-GTGGTGTAGAGG-CAGGCAT-3′，5′-GTGCTGGTCTCTGGTTACG-A-3′；hGLI1，5′-TCAAAGTGGGAGGCACAAAC-3′，5′-ATGGGAAGGAGGAGGACTCA-3′；hIFT88，5′-GTTATGATTGGTGCGTGGAAGT-3′，5′-GG-GCTGAGAGATTGGTTGCAG-3′。

1.7 统计学方法

每组实验进行至少3次，采用SPSS 20.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示。应用t检验或单因素方差分析进行各组间均数的比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PTH参与调控软骨肉瘤细胞的增殖

细胞增殖实验结果表明，随着PTH浓度增高，PTH干预组细胞的增殖效应随之增高，并在100 nmol/L浓度达到峰值(图1A)。无血清培养条件下软骨肉瘤细胞的增殖能力明显下降，但PTH可以促进无血清条件下的SW1353细胞增殖，而水合氯醛破坏纤毛结构后，SW1353细胞的增殖能力进一步降低，再加入PTH对软骨肉瘤细胞的促增殖效应不明显(图1B)。因此，我们推测PTH可能通过初始纤毛介导来调控软骨肉瘤细胞的增殖，这种效应可能与纤毛的结构完整性有关。

2.2 PTH参与调控软骨肉瘤细胞的侵袭效应

我们通过Transwell侵袭实验检测PTH在不同纤毛表达水平条件下对SW1353细胞侵袭能力的影响，结果显示，在纤毛诱导组中，给予PTH刺激较对照组能明显增加穿透小室的肿瘤细胞数量，而纤毛解构组中，PTH对肿瘤细胞的促侵袭效应则受到抑制(图2A、B)，表明PTH对肿瘤的促侵袭效应可能与初始纤毛结构的完整性有关。与此同时，通过Western blot实验检测肿瘤细胞表达基质金属蛋白酶MMP9的量来评估软骨肉瘤细胞侵袭能力的变化，结果显示，与对照组相比，PTH能上调MMP9蛋白的表达，无血清诱导初始纤毛表达后，MMP9表达降低，而加入PTH能显著促进纤毛诱导组MMP9表达增加，而在纤毛解构组中，PTH对MMP9的表达无明显促进作用(图2C)。由此推测，PTH能促进软骨肉瘤细胞的侵袭能力，其机制可能是通过由初级纤毛介导的MMP9表达上调而发挥促侵袭的作用。

A：不同浓度重组人PTH(1-84)对软骨肉瘤细胞SW1353增殖能力的影响；B：通过无血清诱导纤毛表达及水合氯醛破坏纤毛结构后，重组人PTH对SW1353细胞增殖能力的影响；与对照组比较，*P<0.05；与无血清组比较，#P<0.05图1 PTH通过作用于初级纤毛促进SW1353细胞的增殖Fig.1 PTH promotes the proliferation of SW1353 cells via the primary cilia

2.3 PTH参与调控初始纤毛的表达

PTH作为重要的内分泌调节因子，是PTHrP/Hedgehog负反馈环路的重要效应分子。而初始纤毛是经典的Hedgehog通路上游的重要组成结构，参与调控细胞分裂周期及多种信号分子的传导。我们从理论上推测，PTH可通过影响初级纤毛来调节细胞的生长发育过程。为了验证这一假设，我们通过荧光染色计数并观察细胞初级纤毛的表达变化。如图3所示，对照组细胞纤毛表达比例为(21.18±3.97)%，PTH组纤毛表达比例为(13.70±1.43)%；在纤毛诱导组(无血清)中，纤毛表达比例上升为(33.88±3.12)%，再加入PTH能下调纤毛表达至(17.35±2.54)%；而在纤毛解构组(水合氯醛)中，纤毛表达量为(9.38±0.62)%，再给予PTH刺激也未见明显变化，纤毛表达量为(10.33±2.67)%。因此推测PTH和纤毛表达之间存在负反馈作用机制(图3)。

A、B：不同条件下穿透小室的软骨肉瘤细胞数(结晶紫染色，×400)；C：Western blot检测各组细胞MMP9的表达水平；与对照组比较*P<0.05；与无血清PTH组比较，#P<0.05图2 PTH通过初级纤毛调控软骨肉瘤细胞的侵袭能力Fig.2 PTH regulates the invasion of chondrosarcoma cells via primary cilia

A：通过荧光染色乙酰化α微管蛋白标记SW1353细胞表面的初始纤毛(红色荧光)，观察不同干预条件下初始纤毛的形态学表现，DAPI蓝染细胞核(×400)；B：显示不同条件下初始纤毛的表达水平；与对照组比较，*P<0.05；与无血清组比较，#P<0.05图3 PTH调节软骨肉瘤细胞初始纤毛的表达水平Fig.3 PTH regulates the primary cilia expression on chondrosarcoma cells

2.4 PTH参与调控Hedgehog信号通路及初始纤毛相关基因的表达

初始纤毛作为多种信号通路的重要组成部分，参与调控细胞的多种生命活动过程，而经典的Hedgehog通路是初始纤毛和PTH共同参与调控的信号通路。Intraflagellar转运蛋白88(IFT88)作为重要的功能蛋白，其基因表达水平体现了初始纤毛的功能变化，GLI1和PTCH1基因则是Hedgehog通路的靶基因，与信号通路的激活有关。我们用RT-PCR检测PTH在不同纤毛表达水平条件下对Hedgehog通路及IFT88基因表达的影响，结果如图4所示，与对照组相比，PTH对GLI1、PTCH1和IFT88基因的表达影响有限，差异均无统计学意义。在纤毛诱导组(无血清)中，GLI1、PTCH1和IFT88基因的表达均明显增高，再加入PTH后这种促表达效应受到部分抑制，但仍高于对照组。而在纤毛解构组(水合氯醛)中，3种基因的表达均受到明显抑制，加入PTH后对基因的表达无明显影响。

A：PTH对Hedgehog通路靶基因GLI1、PTCH1和纤毛相关基因IFT88的影响；B：无血清饥饿诱导纤毛表达，及再加入PTH后对目的基因表达的影响；C：水合氯醛破坏纤毛结构后PTH对相关基因表达的影响；*P<0.05图4 PTH调控Hedgehog信号通路及初始纤毛相关基因的表达Fig.4 PTH regulates the Hedgehog signaling pathway and the expression of genes related to the primary cilia

3 讨论

PTH作为人体内分泌系统的一个重要的调节因子，参与调控骨与软骨组织的发育过程。在正常的软骨组织中，内源性的PTH通过自分泌和旁分泌与受体结合，调控内环境中钙离子的变化，调控细胞的生长发育[3]。然而，异常的PTH表达可在体内引起一系列代谢功能障碍，多项研究发现在某些恶性肿瘤中存在PTHrP的高表达，同时与高钙血症密切相关，在骨肿瘤中则可伴有严重的溶骨性破坏[5-6]。作为一种特殊类型的骨组织肿瘤，软骨肉瘤可以分泌软骨样基质，同时产生广泛的周围骨组织溶骨性破坏，其恶性生物学特性，如增殖和侵袭效应，则与肿瘤的分化程度明显相关，虽然目前其发病机制尚未清楚，但在我们的研究中已经发现，PTH可以正向调控软骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力，而基质金属蛋白酶的表达增加提示了其对周围组织的广泛性破坏能力，加速对细胞外基质的分解从而加速肿瘤侵袭和转移的进程。因此，PTH可能在调节软骨肉瘤的恶性生物学特性过程中发挥关键作用。

同时，初始纤毛作为一种古老的细胞膜表面结构，其参与调控细胞生命活动的作用不断被再认识和发现。有研究发现，正常软骨细胞的初始纤毛表达水平较良性及恶性软骨肿瘤而言明显要高，而在包括软骨肉瘤在内的多种肿瘤组织中均发现肿瘤细胞存在较低表达水平的初始纤毛[11]。由于初始纤毛能感受细胞微环境中的理化刺激，参与调控细胞内多种信号通路的转导，同时参与细胞周期的调控过程，纤毛表达的异常调控可能在肿瘤的异常发育过程中起着关键性作用，因此对初始纤毛表达调控的影响可以为我们认识肿瘤的发展过程提供重要的思路。

在本研究中，我们发现PTH可以增强人软骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力，同时能够抑制初始纤毛及其功能基因IFT88的表达，而这些作用效应又与纤毛结构的完整性有关。反过来纤毛诱导组中可能激活经典的Hedgehog信号通路，PTH抑制纤毛表达的效应可能导致Hedgehog目的基因及纤毛功能基因IFT88的表达部分下调，而破坏纤毛结构后，Hedgehog通路和PTH的作用途径可能均被阻断，从而目的基因表达下调，PTH的作用效果同样受到抑制。我们推测PTH对软骨肉瘤细胞恶性生物学特性的正向调控作用可能依赖初始纤毛的结构和功能。因此，进一步深入探究PTH与初始纤毛的表达调控关系，将为探索软骨肉瘤的发病机制提供新的思路。

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(2016-11-02 收稿)

Parathyroid Hormone Promotes the Proliferation and Invasion of ChondrosarcomaCells by Regulating the Expression of Primary Cilia

Xu Kai1#，Xiang Wei1#，Cheng Weiting2△

1DepartmentofOrthopedics，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofOncology，WuhanHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

Objective To investigate the effect of parathyroid hormone(PTH)on the proliferation and invasion of chondrosarcoma cells，and the relationship between PTH and the regulation of primary cilia expression.Methods After stimulation of the chondrosarcoma cell line SW1353 with different concentrations of PTH，induction of the expression of cilia with hypoxia and destruction of cilia structure with chloral hydrate，the cell viability was detected by CCK8 assay，the proliferation and invasion of SW1353 by Western blotting and Transwell method， the primary cilia expression by immunofluorescence assay and the GLI1，PTCH1 and IFT88 expression levels by real-time PCR.Results PTH could promote the proliferation of chondrosarcoma cells in a concentration-dependent manner and this effect was correlated with the structural integrity of the primary cilia.PTH could up-regulate the invasive ability of SW1353 cells and increase the expression levels of MMP9，which was suppressed when the primary cilia structure was damaged.Additionally，it was found that PTH could down-regulate the number of primary cilia，which was related to the structural integrity of the primary cilia.It could also regulate the expression levels of GLI1 and PTCH1，the target genes in Hedgehog pathway，and the expression levels of IFT88，the gene associated with the cilia function.Conclusion PTH can promote the proliferation and invasion of chondrosarcoma cells，down-regulate the expression of primary cilia and the downstream target genes.PTH may regulate the malignant biological features of chondrosarcoma by regulating the primary cilia expression.

parathyroid hormone； chondrosarcoma； proliferation； invasion； primary cilia

*国家自然科学基金资助项目(No.81672652)；湖北省自然科学基金青年基金资助项目(No.2015CFB213)

R738.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.02.002

#共同第一作者

许 凯，男，1979年生，副主任医师，医学博士，E-mail：godocoto@163.com

向 威，男，1989年生，博士研究生，E-mail：758687410@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：joycvt@163.com