阻断ErbB4受体对人胆管细胞癌QBC939细胞系增殖与转移的影响

彭思远，曾杰宏，谢博文，刘铮凯，张 豹，吕 品，聂盛丹，蒋 波

（湖南师范大学第一附属医院，湖南省人民医院，长沙 410005）

阻断ErbB4受体对人胆管细胞癌QBC939细胞系增殖与转移的影响

彭思远，曾杰宏，谢博文，刘铮凯，张 豹，吕 品，聂盛丹，蒋 波

（湖南师范大学第一附属医院，湖南省人民医院，长沙 410005）

目的：通过体外培养人胆管癌QBC939细胞系，阻断ErbB4受体，检测肿瘤生物学行为的改变，从而探讨人类第4表皮生长因子（ErbB4）受体介导人胆管细胞癌肿瘤生物学行为的分子机制。方法：体外培养人胆管癌QBC939细胞系细胞，分别加入终浓度为0μmol/L，1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L，100μmol/L的AG1478阻断胆管癌细胞ErbB4受体，使用CCK-8法测量各组胆管癌细胞增殖情况，然后利用SPSS软件计算AG1478对人胆管癌QBC939细胞的半数抑制浓度（IC50值）；根据IC50值选择使用0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L AG1478阻断胆管癌细胞ErbB4受体，使用划痕实验检测各组胆管癌细胞迁移能力的变化。分别使用0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L浓度AG1478阻断胆管癌细胞ErbB4受体，使用Transwell小室法实验检测各组胆管癌细胞侵袭能力的变化。结果：AG1478以浓度依赖方式抑制QBC939细胞增殖，其IC50值为：49.14μmol/L；AG1478抑制ErbB4受体后，胆管癌QBC939细胞的迁移、侵袭能力减弱。结论：在体外抑制ErbB4受体能使胆管癌肿瘤细胞生长、迁移、侵袭能力减弱；ErBb4在胆管癌的发生、发展中具有重要的作用，ErbB4可能成为胆管癌分子治疗的新靶点。

胆管癌；ErbB4；增殖；侵袭

胆管癌（cholangiocarcinoma，CC）是一类起源于肝内外胆管上皮细胞的恶性肿瘤［1］，约占胆道恶性肿瘤的1/3，在所有消化道恶性肿瘤中所占的比例约为3%［2］。胆管癌在欧美地区较为少见［3］，但是在我国和东南亚地区发病较多。因此，胆管癌的相关研究对我国具有重要意义。根治性切除术仍是目前胆管癌的主要治疗方式。尽管近年来外科技术进步巨大，胆管癌围手术期死亡率日益减少［4，5］，但根治切除术后预后仍然较差。淋巴结转移、肿瘤体积大、肝内多发转移瘤是胆管癌患者根治术后复发转移的危险因素［6，7］。可见在胆管癌的发生发展中，其肿瘤细胞的增殖与转移对于患者的预后有重要影响。因此，研究胆管癌增殖和转移的分子机制，由此探讨新的靶向治疗方法对改善患者预后有重要意义。在本课题组的前期研究中［8］发现 ErbB4在胆管癌组织中存在过表达，ErbB4表达与肿瘤的淋巴结转移、临床分期相关。本研究拟通过体外培养人胆管癌QBC939细胞系，阻断ErbB4受体，检测肿瘤生物学行为的改变，从而探讨ErbB4受体介导人胆管细胞癌肿瘤生物学行为的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人胆管癌细胞系QBC-939细胞购自美国ATCC公司，由湖南省人民医院临床医学研究所保存。AG1478购自德国SIGMA公司。CCK-8检测试剂盒购自中国唯赞公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞免疫荧光检测QBC-939细胞中ErbB4蛋白的表达 取生长状态良好的QBC-939细胞，用PBS洗涤细胞3次，加入4% 多聚甲醛固定10min。PBS洗涤3次，0.1% Triton X-100-PBS透化10min。PBS洗涤3次，用2% BSA 37℃孵育30min。PBS洗涤3次，ErbB4抗体（1：200稀释）4℃孵育过夜。PBS洗涤3次，用荧光标记的二抗37℃下孵育60min。PBS洗涤3次，DAPI染核，荧光显微镜下观察并照相。

1.2.2 CCK-8法检测AG1478对QBC939细胞增殖影响及IC50值 取对数生长期QBC939细胞系细胞，在96孔板中配置200μL 的细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24小时，吸弃培养基，更换为含不同浓度AG1478培养基，每孔200μL，作为实验组。将培养的细胞悬液，不添加AG1478培养基，作为对照组。将无细胞以及AG1478的培养基作为空白组。将三组每孔加入200μL新鲜配制的含CCK-8的无血清培养基，继续培养4小时，用酶标仪上以检测波长为450nm测定吸光度（A）值。相对细胞存活率（%）按照下列公式计算：细胞存活率（%）=［（A实验-A空白）/（A对照-A空白）］×100%。以上实验重复2次。然后输入对应的浓度及细胞存活率用SPSS软件计算IC50值。

1.2.3 划痕法检测QBC939细胞迁移能力 取人胆管癌QBC-939细胞系细胞，用含10%FBS的DMEM培养基培养48 h至融合度为80%；然后在培养板中央制造相同宽度的划痕，更换为含药物的无血清相应条件培养基处理48h至对照组细胞接近融合，于0、24、48h拍照划痕，并计算在划痕区的细胞数目；设定未处理QBC-939细胞系细胞的迁移细胞数为100%计算相对迁移细胞百分率：细胞迁移率（%）=条件培养基处理组迁移细胞均数/未处理组迁移细胞均数×100%。

1.2.4 Transwell小室结合Matrigel检测QBC939细胞侵袭能力 取人胆管癌QBC939细胞，用含不同浓度AG1478培养基处理24 h；然后，取包被Matrigel基质胶膜的Transwell小室。下室加入600 μL含10% 胎牛血清DMEM培养基，Transwell小室的上室内接种含10000个细胞的无血清培养基400 μL。24 h后，用棉签清除未侵袭通过Matrigel基质胶的细胞。用4%多聚甲醛固定膜下室面上的细胞，并进行瑞氏-姬姆萨染色。在光学显微镜下，计数每孔通过膜侵入至下室面的细胞数目，拍照记录。

1.2.5 Western Blot分析 取经相应处理的细胞，用PBS洗涤细胞3次，加入500 μL含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，刮取、收集并裂解细胞。细胞裂解液经13200× g、4°C 条件下离心10 min，制备全细胞蛋白提取物。用BCA试剂盒测定蛋白质含量。以10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白提取物的蛋白质，并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。在5%（w/v）脱脂牛奶/PBST中进行膜封闭，随后，用实验材料部分描述的一抗在4°C条件下孵育过夜。用PBST洗膜3次，用过氧化物酶标记的相应二抗孵育上述PVDF膜1 h。以增强化学发光试剂盒检测信号。

1.3 统计学分析 实验数据录入SPSS 16.0软件，建立数据库，数据用均数±标准差表示，用One Way ANOVA方式行方差分析。首先进行方差齐性检验，多组均数比较采用LSD法；在方差不齐时，多组均数间比较采用Turkey's检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人胆管癌细胞系 QBC939的培养及ErbB4受体的表达 为了检测ErbB4蛋白在人胆管细胞癌QBC939细胞系细胞中的表达，采用细胞免疫荧光间标的方法。结果显示，ErbB4蛋白在细胞中呈阳性表达，且表达于细胞核外（图1）。

图1 人胆管癌QBC939细胞系细胞ErbB4蛋白表达的荧光显微镜图像（×200）蓝色图像为细胞核，红色信号为ErbB4蛋白

2.2 AG1478对人胆管癌QBC939细胞系细胞增殖的影响及IC50值 为了确定AG1478对QBC939细胞产生作用的最佳时间和浓度区间，在药物处理24h后，CCK-8法检测不同浓度AG1478（1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L，100μmol/L）对QBC939细胞存活率的影响。不同浓度AG1478对细胞存活率结果如表1所示。SPSS软件计算IC50值为49.14μmol/L。

表1 不同浓度AG1478对细胞存活率（n=3）

2.3 AG1478对人胆管癌QBC939细胞系细胞迁移的影响 划痕法检测AG1478（0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）对人胆管癌QBC939细胞系细胞迁移的影响。结果表明：与未用药物处理的QBC939细胞相比，AG1478处理后，QBC939细胞的细胞融合能力明显减弱。

图2 AG1478对胆管癌细胞迁移能力的影响（×100）

划痕法试验分别检测未处理（对照）和AG1478 （25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）处理的人胆管癌细胞系细胞迁移能力。AG1478（25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）与AG1478（0μmol/L）人胆管癌细胞系细胞比较，P＜0.05

图3 AG1478抑制胆管癌细胞迁移作用

2.4 AG1478对人胆管癌QBC939细胞系细胞侵袭的影响 Transwell小室体外侵袭法检测AG1478（25μmol/ L，50μmol/L和75μmol/L）对人胆管癌QBC939细胞系细胞侵袭的影响。结果表明：与未用药物处理的QBC939细胞相比，AG1478处理后，侵袭进入膜下方的QBC939细胞明显减少。

图4 AG1478对胆管癌细胞侵袭能力的影响（×200）

图5 AG1478抑制胆管癌细胞侵袭作用Transwell小室体外细胞侵袭试验分别检测未处理（对照）和AG1478 （25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）处理的人胆管癌细胞系细胞侵袭能力。AG1478（25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）与AG1478（0μmol/L）人胆管癌细胞系细胞比较，P＜0.05

3 讨论

胆管癌是胆道系最常见的恶性肿瘤之一。在临床上，根据解剖位置的不同可以分为肝内胆管癌、肝门胆管癌以及肝外胆管癌［9］。近年来胆管癌的发病率及死亡数正逐年上升［10］，在世界范围内，其发病率约为（1～10）/10万［11］。但是，胆管癌早期诊断困难，大多数病人直到晚期出现了无痛性黄疸、体重下降以及胆管炎等症状后才被发现［12，13］。手术切除仍然是目前胆管癌治疗的最佳方式。文献报道胆管癌行早期根治性切除术，术后的5年生存率低于30%［14］。研究显示胆管癌细胞对放化疗不敏感［15］。因此，我们急需寻求新的治疗方法以改善胆管癌患者的预后。分子靶向治疗已成为目前胆管癌治疗的研究方向。

ErbB4受体为人类第4表皮生长因子受体，它属于表皮生长因子受体家族中的一员，该蛋白在正常的人体组织中有不同的表达。根据国外文献报道，ErbB4蛋白在多种肿瘤组织中存在过度表达［16-18］，提示该蛋白在肿瘤的发生发展中起重要作用。但是ErbB4在胆管癌中的表达未见文献报道。在本课题组的前期研究中发现，ErbB4在胆管癌患者组织标本中存在过表达，提示该蛋白在胆管癌的发生发展中起重要作用。综合上述文献和前期研究结果我们得出：ErbB4在胆管癌组织中存在过表达（图1），ErbB4表达与肿瘤的淋巴结转移、临床分期及不良预后相关。

在本研究中CCK-8结果显示，根据不同浓度AG1478组细胞存活率平均值，计算出的IC50值为49.14μmol/L。结果提示，阻断ErbB4受体能使胆管癌细胞增值能力减弱。划痕试验结果显示，胆管癌细胞的迁移能力随AG1478浓度升高逐渐减弱，提示阻断ErbB4受体的表达能引起胆管癌细胞迁移能力减弱。为了进一步探讨阻断ErbB4对胆管癌细胞侵袭能力的影响，我们进行了Transwell小室体外细胞侵袭试验。结果显示，阻断ErbB4受体的表达能引起胆管癌细胞侵袭能力逐渐减弱。这些实验结果均支持我们提出的假说，即ErbB4受体能通过介导其下游信号通路，增强胆管癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力。

综上所述，本研究通过在体外抑制ErbB4受体，检测发现胆管癌肿瘤细胞生长、迁移、侵袭的能力明显减弱，从而证明ErBb4在胆管癌的发生、发展中具有重要的作用，ErbB4可能成为胆管癌分子治疗的新靶点。诚然，本文仅为对细胞学的基础实验研究，抗ErbB4单克隆抗体相关药物在体内的抑瘤效果如何，这尚有待于进一步的研究。

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Effects of blockade of ErbB4 on proliferation, migration, invasiveness in human cholangiocarcinoma QBC939 cell line

Peng Si-yuan, Zeng Jie-hong, Xie Bo-wen, Liu Zheng-kai, Zhang Bao, Lv Pin, Nie Sheng-dan, Jiang Bo
(Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410005, China)

Objective Human cholangiocarcinoma QBC939 cells were cultured in vitro, blockade of ErbB4, to investigate the molecular mechanisms that ErbB4 effects on oncobiology. Methods Human cholangiocarcinoma QBC939 cells were cultured in vitro, 0μmol/L, 1μmol/L, 5μmol/L, 10μmol/L, 25μmol/L, 50μmol/L, 75μmol/L, 100μmol/L AG1478 were blocked ErbB4 receptor, the proliferation of cholangiocarcinoma cells were measured by CCK-8 assay, moreover, median inhibitory concentration (IC50) of AG1478 in cholangiocarcinoma cells were calculate with SPPS software. After treating with 0μmol/L, 25μmol/L, 50μmol/L, 75μmol/L AG1478, wound-scratch assay was used to detect the ability of migration, Transwell chamber assay was used to detectd the ability of invasiveness of cholangiocarcinoma cells. Results AG1478(0μmol/L, 1μmol/L, 5μmol/L, 10μmol/L, 25μmol/L, 50μmol/L, 75μmol/L, 100μmol/L) inhibited QBC939 cell proliferation, in a dose-dependent manner, IC50 value is 49.14μmol/L. After inhibiting ErbB4 receptor, the migration and invesiveness of QBC939 cells were attenuated. Conclusion After inhibiting ErbB4 receptor, the proliferation, migration and invasiveness of QBC939 cells were attenuated. The study indirectly indicates that ErbB4 may play a significant role in cholangiocarcinoma and may serve as a molecular target for anticancer therapy.

cholangiocarcinoma; ErbB4; roliferation; invasion

R735.8

A

1673-016X（2017）02-0023-04

2016-12-11

湖南省卫生厅医药卫生科研计划资助项目（B2012-088）；湖南省教育厅重点项目（15A114）

蒋波，E-mail:jiangbo@medmail.com.cn