循环microRNA-1268在肺癌血浆中检测分析及临床意义

李 赛，阳学风，胡 甜，张楚红，吕 秀，贺 莎，严汉兴，谭贻兮，陈荣如，文美玲，李金成，左建宏

（1. 南华大学附属南华医院，衡阳 421000；2. 南华大学医学院，衡阳 421000；3. 邵阳学院医学部，邵阳 422000）

循环microRNA-1268在肺癌血浆中检测分析及临床意义

李 赛1，2，阳学风1，胡 甜1，2，张楚红1，吕 秀1，贺 莎1，严汉兴1，谭贻兮1，陈荣如1，文美玲1，李金成3，左建宏1，2

（1. 南华大学附属南华医院，衡阳 421000；2. 南华大学医学院，衡阳 421000；3. 邵阳学院医学部，邵阳 422000）

目的： 探讨循环microRNA-1268（miRNA-1268）在肺癌血浆中的表达情况，并分析其与临床病理特征的相关性及其在肺癌诊断及预后判断中的意义。方法：采用实时荧光定量PCR方法检测miRNA-1268在39例肺癌患者和作为对照组的39例正常人血浆中的相对表达量，并评估其临床意义。结果：肺癌血浆中miRNA-1268的表达水平明显高于正常人，差异有统计学意义；血浆循环miRNA-1268相对表达量ROC曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）为0.680，95%CI为0.562-0.799，取临界值0.054时，血浆miRNA-1268表达诊断肺癌的灵敏度为74.4%，特异度为59.0%；miRNA-1268的表达水平与肿瘤TNM分期相关，而与患者性别、年龄、吸烟、肿瘤大小、淋巴结转移、组织分型、CEA水平无相关性；Kaplan-Meier分析结果显示肺癌血浆中miR-1268高表达者生存时间明显低于低表达者，差异有统计学意义。结论：循环miRNA-1268在肺癌血浆中表达上调，对肺癌有一定的临床诊断及预后判断意义，可作为诊断肺癌和判断预后的一个新的标志物。

肺癌；循环microRNA-1268；诊断；预后；实时荧光定量PCR

肺癌是全世界癌症死亡率的主要原因。据统计，2012年肺癌导致的死亡人数高达159万人［1］，并且肺癌的发病率呈现出上升趋势。大多数患者在出现症状后或得到确诊时，已属疾病晚期，不具备手术治疗的指证，虽然放化疗和靶向药物为患者提供了一线生机，但肺癌的5年生存率仍然很低：数据表明，肿瘤分期为IA期的非小细胞肺癌患者5年生存率为80%，而IV期患者只有10%［2］；经过治疗的局限期小细胞肺癌患者的中位生存期约为18～24个月，而经过治疗的广泛期小细胞肺癌的中位生存期约为6～12个月，未经治疗的广泛期小细胞肺癌的中位生存期仅有2～4个月［3］。传统的检查方法如胸片和痰找脱落细胞，这些方法敏感性和特异性低，限制了其临床应用价值；近年来发现低剂量螺旋CT对肺癌的诊断更敏感，但诊断肺癌的特异性只有61%［4］；作为诊断肺癌金标准的经皮肺穿刺活检术是一种侵入性的手术，给病人带来相应的风险。综上所述，我们急需一种早期、有效、无创的检测肺癌的方法，而microRNAs被认为是一种潜在的作为肺癌诊断的标志物。

小分子核糖核酸（microRNAs）是一类非编码小分子RNA，长度约为19～22个核苷酸［5、6］，在基因转录后调控中发挥作用［7、8］。许多研究表明，microRNAs （miRNAs）不仅参与正常的生物过程，如分化、细胞增殖和细胞凋亡，还在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用，包括肺癌［9-12］。MiRNAs不容易被核糖核酸酶降解，可以在血液中保持稳定［13、14］，2008年Mitchell［15］and Chen［16］首先报道了血浆和血清中含有大量的稳定的miRNAs。此外，miRNAs取样方便、无创，而且可连续监测，这些特征更加突出miRNAs的作为肿瘤诊断标志物的优势。

近年来有很多关于循环miRNA作为肿瘤诊断标志物的文献报道，但是迄今为止，尚未发现关于循环miRNA-1268在肺癌中表达的报道，本研究通过检测肺癌患者血浆中miRNA-1268的表达水平变化，分析其与临床病理特征的相关性及其在肺癌诊断及预后判断中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集 2014年7月～2015年9月在湖南省衡阳市南华大学附属南华医院住院治疗的肺癌患者血浆样本及正常人血浆样本分别39例。肺癌血浆样本中男31例，女8例；组织病理类型为腺癌14例、鳞癌25例。根据2010年国际抗癌联盟（UICC）制定的TNM分期标准进行临床分期，I-II期12例，III-IV期27例。收集患者及正常人外周血3ml，在4°C条件下离心5分钟，转速3500r/min，取上清液后立即转入-80°C 冰箱保存，整个收集及保存过程均按照无酶原则操作。

1.2 方法 总血浆RNA提取通过miRNeasy Plasma试剂盒（Qiagen公司，德国）提取，操作根据试剂盒说明进行；然后使用miScript II RT试剂盒（Qiagen公司提供）逆转录得到cDNA，接着采用实时荧光定量PCR进行扩增（该步骤使用miScript SYBR Green PCR试剂，由Qiagen 公司提供）。每个样本real time PCR进行3次。采用cel-miR-39作为内参，miRNA-1268在肺癌血浆中的相对表达量采用2-ΔCt方法计算，其中ΔΔCt＝ΔCt（miR-1268-内参）（肺癌组）－ΔCt（miR-1268-内参）（正常组），并以2-ΔCt形式表示，其中ΔCt＝Ct（miR-1268）-Ct（cel-miR-39）。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0软件进行统计分析，作图采用Graph PadPrism v5.0软件；数据以均数±标准差（± s）表示，所有分析均采用独立样本t检验。通过ROC曲线（SPSS软件）计算曲线下面积、临界值和灵敏度、特异度，并评价血浆miRNA-1268对于肺癌诊断的价值。生存分析采用Kaplan-Meier分析，组间比较采用Log-rank 法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MicroRNA-1268在肺癌血浆中的表达。 在肺癌患者血浆中miRNA-1268相对当于内参的表达量为：0.22±0.33；而正常人血浆中miRNA-1268相对表达量为：0.09±0.12，肺癌患者血浆中miRNA-1268的表达水平明显高于正常人（P=0.025）（图1）。肺癌血浆中有28例（71.8%）miRNA-1268表达上调（图2）。

图1 miRNA-1268在肺癌血浆中的表达量，以2-ΔCt表示，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）

图2 肺癌组miRNA-1268上调倍数（相对于正常组），以log2形式表示

2.2 miRNA-1268的表达水平与肺癌临床病理特征之间的关系

血浆miRNA-1268相对表达量与肺癌患者临床病理特征之间的相关性分析结果见表1。MiRNA-1268的表达水平与肿瘤TNM分期相关（P＜0.05）：与I-II期肺癌相比较，III-IV期肺癌血浆中miRNA-1268的表达水平明显上调（P＜0.05）；而miRNA-1268 的表达水平与患者性别、年龄、吸烟、肿瘤大小、CEA水平、肿瘤组织分型及淋巴结转移无明显相关性。

2.3 血浆miRNA-1268相对表达量的ROC曲线分析

对血浆miRNA-1268相对表达量运用SPSS软件做ROC曲线分析，如图C所示，血浆循环miRNA-1268相对表达量ROC曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）为0.680，95%CI为0.562-0.799（P＜0.01），取临界值0.054时，血浆miRNA-1268表达诊断肺癌的灵敏度为74.4%，但特异度较低，为59.0%。

表1 肺癌血浆miR-1268高表达与临床病理特征间关系（± s）

表1 肺癌血浆miR-1268高表达与临床病理特征间关系（± s）

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图3 血浆miRNA-1268相对表达量的ROC曲线分析

2.4 血浆miRNA-1268的表达与肺癌患者的预后关系

3 9例肺癌患者中有 1 例患者失访。根据miRNA-1268的平均表达水平将所有肺癌 患者分为低表达组和高表达组。如图4所示，通过Kaplan-Meier进行分析，miRNA-1268高表达组和低表达组的生存时间分别为13.09±6.06和19.32±5.25个月，miRNA-1268高表达者生存时间明显低于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 血浆miRNA-1268的表达与肺癌患者生存时间的关系

3 讨论

肺癌的死亡率居恶性肿瘤之首，5年生存率低，多数肺癌患者在得到确诊时已属疾病晚期，因此，寻找一种早期、有效的诊断肺癌的生物标志物显得尤为迫切。MiRNAs是一类长度约为19-22个核苷酸的非编码RNA，在基因转录后水平发生调控作用。MiRNAs通过特异性结合目标信使RNA（mRNA）的3’端非翻译区（3’-UTR），最终导致mRNA的直接降解或者翻译抑制。血液中的miRNA可以稳定存在，不易被内源性RNA酶降解。大量研究表明miRNA的异常表达与包括肺癌在内的多种恶性肿瘤密切相关，可作为肺癌诊断的有应用前景的新型生物标志物。

2004年Takamizawa等［17］首次将miRNA的表达和肺癌联系起来，自此有关肺癌和miRNA的研究越来越多，miRNA在肺癌诊断及预后中的重要作用受到广泛关注。Chen［16］等首次发现非小细胞肺癌的血清miRNA表达谱相对于健康人的有显著差异，其中有28个正常血清miRNA没有在非小细胞肺癌的血清中被检测到，此外，有76中血清miRNA在肺癌血清中检测到，这暗示血清miRNA可能是诊断非小细胞肺癌的潜在生物标志物。Hu等［18］通过检测152例肺癌血清样本和75例健康人血清样本，发现miRNA-25和miRNA-223在肺癌中的表达相对于对照组显著上调，表明血清miRNA-25和miRNA-223可能是非小细胞肺癌的特异性miRNA。Wei［19］等发现使用血浆miRNA-21作为诊断非小细胞肺癌的标准，其敏感性和特异性分别为76.2%，70%。此外，Chen等［20］在一项研究中已经明确了由10种在非小细胞肺癌中差异表达的血清miRNA构成的生物标志物模型，并且ROC曲线分析表明，这10种miRNA诊断非小细胞肺癌的敏感性和特异性分别为92.5%和90%。大量研究结果表明，miRNAs的表达与肺癌患者的生存期相关。血清miRNA-21低表达与肺癌患者的低生存时间有关［21-22］。高表达miRNA-141 和 miRNA-200c的肺癌患者总生存时间缩短［23］。近几年来，关于循环miRNAs的研究越来越多，但关于循环miRNA-1268在肺癌中的表达尚不清楚，本研究通过检测肺癌患者血浆中miRNA-1268的表达水平变化发现：在肺癌患者血浆中miRNA-1268的表达水平明显高于正常人，说明在肺癌中miRNA-1268表达是上升的，且miRNA-1268高表达者生存时间明显低于低表达组，进一步分析发现miRNA-1268的表达水平与肿瘤TNM分期相关，与I-II期肺癌相比较，III-IV期肺癌血浆中miRNA-1268的表达水平明显上调，这些结果提示miRNA-1268可能作为一种癌基因参与肺癌的进展和转移，血浆miRNA-1268可能是肺癌的特异性循环miRNA，对肺癌患者的诊断及预后判断有重要价值。本研究还发现，血浆miRNA-1268相对表达量ROC曲线下面积为0.680，诊断肺癌的灵敏度为74.4%，但特异度较低，为59.0%，该结果提示血浆miRNA-1268对肺癌的诊断具有较好的灵敏度。

总之，本研究发现血浆miRNA-1268对肺癌的诊断及预后判断有一定临床意义，但miRNA-1268调控肺癌的具体机制及相关靶基因尚不明确，仍需我们更加深入研究。

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Analysis of circulating microRNA-1268 in plasma of lung cancer and its clinical significance

Li Sai1,2, Yang Xue-feng1, Hu Tian1,2, Zhang Chu-hong1, Lv Xiu1, He Sha1,Yan Han-xing1,Tan Yi-xi1,Chen Rongru1,Wen Mei-ling1, Li Jin-cheng3,Zuo Jian-hong1,2
(1.Affiliated Nanhua Hospital， University of South China, Hengyang 421000,China;2. Department of Medicine, University of South China, Hengyang 421000, China3. Department of Medicine, Shaoyang University, Shaoyang 422000, China)

Objective To discuss the expression of circulating miRNA-1268 in lung cancer plasma and to analyze its diagnostic and prognostic evaluation value in lung cancer. Methods Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detectthe relative expression level of circulating miRNA-1268 in 39 lung cancer patients (cancer group) and 39 healthy people (control group). Results The expression of miRNA-1268 in the cancer group was up-regulated compared with the control group. The area under the ROC curve was 0.680, and the 95%CI was 0.562～0.799, its sensitivity in the diagnosis of lung cancer was 74.4% and its specificity was 59.0% when the relative expression level of circulating miRNA-1268 was 0.054. The expression of miRNA-1268 was related to tumor stage, and no obvious correlation was found between the expression of miRNA-1268 and some pathological characteristics such as gender, age, smoke, CEA, tumor size, lymph node metastasis and tissue typing. Kaplan and Meier analysis results show that there was significant difference between the expression of plasma miR-1268 and overall survival of lung cancer, patients with high expression of miR-1268 showed shorter survival than those with low expression of miR-1268. Conclusion The up-regulated expression of circulating miRNA-1268 has certain value in the diagnosis and prognostic evaluation of lung cancer, and it may be a useful diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer.

lung cancer; circulating microRNA-1268; diagnosis; prognosis; real-time fluorescent quantitative PCR

R734.2

A

1673-016X（2017）02-0016-05

2016-12-31

国家自然科学基金（81272960）；湖南省科技厅重点项目（2013WK2010，2014SK2015）；人社部重点项目【2016】176号和天晴肝病研究基金

李金成，E-mail:hnsyljc63@163.com；左建宏，E-mail:

632138414@qq.com