卡介苗免疫小鼠抗体的检测及动态分析

喻 勇，刘 攀，许瀚元，周玉凡，文世锦，彭 迁，王 琼，申 丽，张 冉

（1.湖南师范大学医学院，长沙410013；2.泰和医院，长沙410005）

卡介苗免疫小鼠抗体的检测及动态分析

喻 勇1，2，刘 攀1，许瀚元1，周玉凡1，文世锦1，彭 迁1，王 琼1，申 丽1，张 冉1

（1.湖南师范大学医学院，长沙410013；2.泰和医院，长沙410005）

目的：研究卡介苗初次免疫和再次免疫Balb/c小鼠后，抗PPD IgG、IgM抗体的检测，并探索其动态变化规律。方法：健康雌性Balb/c小鼠，随机分成腹部皮内注射BCG组和生理盐水对照组，先后进行2次免疫。应用间接ELISA法，检测血清中特异性抗PPD IgG、IgM抗体。 结果：自初次免疫第50天开始，抗PPD IgG抗体的总体OD值均数，BCG免疫组与对照组相比，差异具有统计学意义。第60天再次免疫，第65天开始，抗PPD IgG抗体的总体OD值均数，其差异具有统计学意义，而抗PPD IgM抗体的总体OD值均数与对照组相比，差异没有统计学意义。结论：BCG初次免疫Balb/c小鼠后，抗PPD IgG抗体整体呈上升趋势，再次免疫后，可在短时间内快速上升，并在长时间内维持一个较高水平。抗PPD IgM抗体没有显示动态变化。

卡介苗；抗PPD抗体；效价动态变化

引发结核病的结核分枝杆菌是一种世界范围内危害人类健康的主要病原菌。2016年4月份国家卫生计生委疾病预防控制局公布的全国法定报告传染病发病、死亡统计表显示，肺结核的发病数是103397例，死亡数是148例，均居第二位［1］。由于结核病的早期临床症状不明显，一般的诊断方法难以在较短时间内做出明确的诊断。现在常用的结核杆菌检测技术，无法满足临床诊断需求。当结核分枝杆菌感染机体后，菌体蛋白和毒素等物质进入血液，刺激机体产生抗体，比如IgG、IgM等。本实验通过检测接种卡介苗（减毒活疫苗）后，小鼠血清抗体的动态变化，为结核病的早期临床诊断提供实验数据。

1 资料与方法

1.1 材料 实验动物为Balb/c小鼠，购自湖南斯莱克景达技术有限公司，雌鼠15只，质量12～15g，21日龄，分笼饲养。卡介苗和卡介苗纯蛋白衍生物（PPD）均购自成都生物制品研究所，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgM均购自SouthernBiotech，吸附板和明胶缓冲液均购自于Sangon Biotech。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与免疫 将实验动物随机分组为注射BCG 组（n = 10）和生理盐水对照组（n =5），实验组每只小鼠均腹部皮内注射含有1×105CFU的卡介苗50ul，对照组注射生理盐水50ul。以第一次免疫日期为起始时间，在第60天，进行第二次免疫。全程每隔5天采集一次血样，共采集23次。血清分装后置-35℃以下低温保存。

1.2.2 用棋盘法确定最佳PPD抗原包被浓度和血清稀释倍数 将PPD按照1.0ug/ul、0.6ug/ul、0.2ug/ul、0.1ug/ ul、0.05ug/ul五个稀释浓度包板。将阳性血清按照1：100、1：400、1：800、1：1600、1：3200五个稀释倍数加样。酶标二抗稀释比例为1：5000，用酶标仪在450 nm波长下检测OD值，当阳性标本OD值/阴性对照OD值≥2.1时，并阳性对照的OD值最接近于1.0时，即为最佳PPD包板浓度和样本的稀释倍数。

1.2. 3 间接ELISA法检测各次血样中抗PPDIgM、IgG抗体 以棋盘滴定法的最佳抗原浓度和最佳血清稀释倍数包板和加样，酶标二抗稀释倍数为1：5000，在450 nm波长下检测OD值。

1.2.4 统计学处理 应用SPSS 17.0进行统计学分析，所有数据用One-way ANOVA进行方差分析，SNK检验进行显著性分析。

2 结果

2.1 棋盘法确定最佳PPD抗原包被浓度和血清稀释倍数 根据所得结果，确定最佳PPD抗原包被浓度为1ug/ml，血清最佳稀释度1：400。

2.2 初次免疫，再次免疫后不同时间点抗PPD抗体IgG的检测结果 在BCG初次免疫小鼠后，小鼠血清中抗PPD抗体IgG的效价整体呈缓慢上升趋势，再次免疫后，呈快速上升趋势。由图1可见，在第1天到第110天，F=4.349， P＜0.05，按α=0.05水准，认为第1天到第110天的各个时间点，BCG免疫组与对照组之间的总体OD值均数间差异具有统计学意义，经多重比较结果显示，按α=0.05水准，从第1天到第50天的各个时间点，BCG免疫组与对照组之间的总体OD值均数差异没有统计学意义，在第55天，BCG免疫组与对照组之间的总体OD值均数差异具有统计学意义。再次免疫后，在第65天，BCG免疫组与对照组之间的总体OD值均数差异具有统计学意义（图1）。2.3 初次免疫，再次免疫后不同时间点抗PPD抗体IgM的检测结果

图1.初次免疫，再次免疫后各时间点小鼠血清中抗PPD抗体IgG的效价

小鼠血清中抗PPD IgM抗体的效价从第1天到第110天，F=0.386， P=0.996，按α=0.05水准，BCG免疫组与对照组之间的总体OD值均数差异没有统计学意义（图2）。

图2 初次免疫，再次免疫后各时间点小鼠血清中抗PPD抗体IgM的效价

3 讨论

我国是世界上22个结核病（tuberculosis，TB）高负担国家之一，TB患者数量占全球 10%［2］。准确检测和诊断是结核病的防控难点之一，当前我国常用的TB诊断方法主要分为以下5类：细菌学检测、病理学检测、影像学检测、分子生物学检测以及血清学检测［3］。其中血清学诊断具有简单、快速、灵敏、特异、稳定及易于自动化操作等特点，目前在临床已广泛应用［4］。

当抗原刺激机体免疫系统后，B淋巴细胞可分化增殖为浆细胞，生成各类抗体并产生特异性免疫应答。抗体的有无、种类、效价、以及亲和力，对疾病的诊断具有诊断意义，IgG是血清和胞外液中含量最高的免疫球蛋白，是再次免疫应答的主要抗体，并且在体内分布广泛。IgM是当机体感染后最早出现的抗体，可用于疾病的早期临床诊断。

结核分枝杆菌是胞内寄生菌，主要诱导细胞免疫应答，但也会诱导机体产生抗体。在S. de Vallie `re等人的研究中，初次免疫卡介苗后，志愿者血清中特异性抗脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗体IgG会逐渐升高，间隔六个月后再次加强免疫，可诱导特异性抗脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗体IgG显著增加［5］。国内也有文献报导，卡介苗免疫Balb/c小鼠和昆明鼠后，抗PPDIgG抗体水平会随着时间的延续，呈现出一种缓慢上升－明显上升－缓慢上升－明显上升的趋势［6］。但是，卡介苗免疫后，抗PPDIgM抗体动态变化未见相关报导。

为了探索卡介苗初次免疫和再次免疫Balb/c小鼠后，血清中抗PPDIgG、IgM抗体的动态效价变化，本实验分别在间隔等长时间的不同时间点采集血样，经ELISA检测及统计学分析，结果表明，与对照组相比，抗PPDIgG抗体具有动态效价变化，BCG初次免疫Balb/c小鼠后，抗PPDIgG抗体在前期上升缓慢，后期逐渐升高，整体呈上升趋势，再次免疫后，可在短时间内快速上升，并在长时间内维持一个较高的效价水平。而在本实验中，抗PPDIgM抗体在初次免疫与再次免疫的过程中，与对照组相比，均没有显示有意义的动态变化。

从我们了解到的临床数据，在100例最后确诊是活动性肺结核患者的血清样本中，检测到结核抗体IgG阳性标本31例，IgM阳性标本0例（本数据分析另文发表），此结果与本研究的实验数据相吻合：结核分枝杆菌感染机体后，能诱导抗PPD IgG抗体的产生，而是否能诱导抗PPD IgM抗体的产生，以及IgM抗体的动态变化，其机理尚未查明，还有待于进一步探讨。

综上所述，抗PPD IgG、IgM抗体的动态变化能为临床诊断提供相关实验数据，无论是卡介苗的初次免疫还是再次免疫，都能引起抗PPD IgG抗体的增高，并且在再次免疫后，其效价会迅速增高，而抗PPD IgM抗体没有显著的效价变化。

［1］ 2016年4月全国法定传染病疫情概况［EB/OL］. http: // www. nhfpc. gov. cn / jkj /s 3578 /201605/d6acea93dcac451e91c4b913e36f3553. shtml

［2］ WHO. Global tuberculosis report 2015 ［EB/OL］. http: //www. who. int/ tb/publications/global_report/en/. Geneva: World HealthOrganization: 2016

［3］ 李亮, 许绍发. 中国结核病诊疗现状及展望［J］. 中国实用内科杂志, 2015, 8(35): 643-646.

［4］ 谭笑. 结核病实验室快速诊断方法的研究［J］. 湖南师范大学学报(医学版), 2007, 4(2): 58-59.

［5］ de Vallière S, Abate G, Blazevic A, et al. Enhancement of innate and cell-mediated immunity by antimycobacterial antibodies［J］. Infect Immun, 2005, 73(10): 6711-6720.

［6］ 武月章, 安潇潇, 张文慧, 等. BCG 免疫对小鼠血清特异性抗体与脾脏免疫相关细胞因子表达的影响［J］ . 吉林农业大学学报, 2015, 37(6): 726～730.

Detection and Dynamic Analysis of Antibodies in Mice Immunized with BCG

Yu Yong1, 2, Liu Pan1, Xu Han-yuan1, Zhou Yu-fan1, Wen Shi-jin1, Peng Qian1, Wang Qiong1, Shen Li1, Zhang Ran1
(1. Hunan Normal University, Changsha 410013, China; 2. Tai He Hospital, Changsha 410005, China)

Objective To detect the PPD-specific IgG levels and IgM levels induced by BCG in mice, and explore the dynamic changes. Methods Healthy female Balb/c mice were randomly divided into groups within the abdomen intradermal injection of BCG and saline control group, and were immunized twice successively. Specific anti-PPDIgG、IgM antibodies in serum were detected by indirect ELISA. Results After the first immunization, compared with the control group, the differenceof anti-PPD IgG antibodies overall mean OD value from the 50th day was statistically significant in BCG immunized group. Reimmunization was performed onthe 60th day. The difference of anti-PPD IgG antibodies overall mean OD value in the 65th daywas statistically significant. But in the whole process of immunization, the anti-PPDIgM OD values overall mean difference was not statisticallysignificant. Conclusion After the first immunization, the titer of anti-PPD IgG antibodies was detected in a significantincrease trend. After the second immunization, the titer of anti-PPD IgG antibodies had a rapid rise in a short time, and maintained a high level for a long time. The titer of anti-PPDIgM had no dynamic changes.

BCG; anti-PPD antibody; titer dynamic changes

R446.6

A

1673-016X（2017）02-0020-03

2016-12-30

湖南省基础医学重点学科，国家自然科学基金青年项目

（No:81100054）；2012年湖南省普通高校教学改革研究项目

（121-0257）；湖南师范大学大学生创新基金（043-0094）通讯作者：张冉，E-mail:zhangran00889@aliyun.com