KCTD10基因干扰RNA慢病毒载体的构建

丰 昀，张 敏，彭文婷，李映蓉，杨 倩，蒋乐龙，王光伟

（1.长沙市中心医院眼科，长沙 410004；2.湖南医药学院，怀化 418000）

KCTD10基因干扰RNA慢病毒载体的构建

丰 昀1，张 敏1，彭文婷2，李映蓉2，杨 倩2，蒋乐龙2，王光伟2

（1.长沙市中心医院眼科，长沙 410004；2.湖南医药学院，怀化 418000）

目的：构建KCTD10干扰RNA慢病毒载体。方法：合成KCTD10干扰序列，构建GV248-KCTD10-RNAi慢病毒干扰载体，利用PCR与测序验证阳性克隆。将KCTD10 siRNA干扰病毒载体与质粒pHelper1.0和质粒pHelper2.0三个载体共同转染293T细胞，使细胞合成并分泌释放病毒颗粒。收集病毒颗粒并检测病毒滴度。结果：GV248-KCTD10-RNAi慢病毒载体成功被连接转化，测序结果与设计序列一致；共转后收获KCTD10 siRNA慢病毒颗粒，检测其滴度为5×108TU/mL。结论：成功包装了KCTD10 siRNA慢病毒颗粒，为后续进一步研究KCTD10基因在糖尿病视网膜病变中的作用奠定了基础。

糖尿病视网膜病变；KCTD10；慢病毒载体；干扰RNA

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见和严重的并发症之一，是一种具有特异性改变的眼底病变，已成为致盲的重要病因之一。临床上根据是否出现视网膜新生血管将其分为非增殖性糖尿病性视网膜病变（nonproliferative diabeticr-etinopathy，NPDR）和增殖性糖尿病性视网膜病变（proliferative dia betic retinopathy，PDR）［1-2］。DR主要是由高血糖引起的视网膜微血管系统的病变，其发病过程涉及多种血管源性生长因子的参与以及新生血管的不同变化［3］。KCTD10（Potassium channel tetramerization domaincontaining 10 gene）在心脏发育及血管系统的形成中具有重要作用［4-6］，且KCTD10 / MVK（rs2338104）在非裔美国人和墨西哥裔美国人群中与老年性黄斑变性有关［7］。因此本研究拟构建KCTD10干扰慢病毒载体，为研究KCTD10在DR中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大肠杆菌E.coli DH5α实验室储存；GV248慢病毒重组载体（hU6-MCS-Ubiquitin-EGFPIRES-puromycin）、慢病毒包装载体pHelper 1.0、 pHelper 2.0购自上海吉凯基因化学技术有限公司；293T细胞株由湖南师范大学生命科学院馈赠；限制性内切酶Hpa I 和Xho I为NEB公司产品，T4 DNA连接酶，Taq聚合酶为TaKaRa产品；PCR试剂盒、反转录试剂盒购自唯赞生物公司；去内毒素中量提取质粒试剂盒购自天根生物公司。DMEM、胎牛血清、胰酶、双抗均购于Gibico公司；脂质体 LipofeCtamine2000购于美国Invitrogen公司；250 bp DNA Ladder 与1 kb DNA Ladder购自Thermo Scientific；

1.2 主要实验仪器 2720 Thermal Cycler型 PCR 仪，EPS 200型电泳仪，天能凝胶成像仪，HZ-9211K型菌摇床，GHP-9080型恒温培养箱JB-CJ-2FX型超净工作台，Legend Micro 17型高速离心机，奥林巴斯荧光显微镜，Thermo细胞培养箱；

1.3 实验方法

1.3.1 siRNA靶点设计 RNAi 靶点序列由湖南师范大学医学院任凯群老师馈赠，其序列如下：

Target Seq GC% CCAGCAATTCTGACGACAA 47.4%

1.3.2 双链DNA oligo的制备 在干扰序列的5’端加入Ccgg作为RNA聚合酶依赖的启动子，3’端加入TTTTTG作为RNA聚合酶依赖的终止子。shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔，组成发夹结构。根据shRNA的结构合成单链引物如下：

ID Seq（5’ → 3’）GV248-KCTD10-1 CcggCCAGCAATTCTGACGACAACTCGAGTTGTCGTCAGAATTGCTGGTTTTTg GV248-KCTD10-2 aattcaaaaaCCAGCAATTCTGACGACAACTCGAGTTGTCGTCAGAATTGCTGG

1.3.3 RNA干扰载体的构建 合成后成对的引物干粉溶解于退火缓冲液，90℃水浴 15 min，自然冷却至室温，使其形成退火双链 DNA。用限制性内切酶Age I和EcoR I对GV248（图1）进行双酶切，得到线性质粒载体，将退火双链 DNA与其进行混合，加入T4 DNA连接酶，16℃过夜。连接体系如下：

试剂 体积（μL）线性化载体（100 ng/μL） 1双链 DNA（100 ng/μL） 1 10×T4 DNA ligase 缓冲液 2 T4 DNA ligase 1 dd H2O 至20

将连接产物转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，扩大培养，涂板并筛选阳性克隆。在超净工作台中，用无菌枪头挑单个菌落至 20 μL 鉴定体系中，吹打混匀，用GV248通用引物 H1-F（2479-2502）：GGAAAGAATAGTAGACATAATAGC，Ubi-R （3125-3104）：ATGTCCTTCTGCTGATACTGGG对阳性克隆进行PCR扩增，并将PCR产物进行测序。

PCR反应体系如下：

PCR 反应条件：

图1 GV248慢病毒载体图谱

1.3.4 shRNA慢病毒的包装 测序成功后将慢病毒包装系统的三个质粒进行扩增，根据天根公司质粒提取试剂盒说明书用试剂盒进行质粒提取，并测定质粒浓度及纯度，确保所提DNA的A260/A280值在1.8～2.0之间。铺密度为5× 106细胞/15 mL的对数生长期的 293T细胞于10 cm的细胞培养皿培养过夜。转染前将293T细胞培养液换成无血清培养基，向一灭菌离心管中加入所制备的各 DNA 溶液（GV248载体质粒 20 μg、pHelper1.0 载体质粒 15 μg、 pHelper 2.0 载体质粒 10 μg），与相应体积的Lip2000转染试剂混合均匀，用无血清的培养基调整总体积为 1 mL，在室温下温育15 min使其形成DNA复合物。将混合液缓慢滴加入293T细胞，培养6h后更换新鲜培养基，继续培养48h 后收获细胞上清液并浓缩病毒，分装后-80℃长期保存。取其中一支进行病毒滴度测定。

2 结果

2.1 阳性克隆测序结果 将重组阳性克隆进行PCR扩增，得到单一产物，将产物进行测序，对测序结果与目的载体的引物序列进行比对，其结果如下：

应用 EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits（QIAGEN，德国）进行基因组甲基化修饰，并对修饰后的DNA进行反复洗脱、纯化，洗脱纯化的DNA放入-20℃保存。取质检合格的上述基因组DNA样本进行PCR扩增，并将PCR扩增产物回收。回收的PCR扩增产物送上海生工测序，并采用BiQ Analyzer分析软件对RANK基因组标准序列和测序序列进行比对。

TAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAAT TATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAAC TTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGT GGAAAGGACGAAACACCGGCCAGCAATTCTGACGAC AACTCGAGTTGTCGTCAGAATTGCTGGTTTTTGAATT CTCGACCTCGAGACAAATGGCAGTATTCATCCACGG ATCCTAACCCGTGTCGGCTCCAGATCTGGCCTCCGCG CCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTC ACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGC GAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACA GCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCC CAGTATCAGCAGAAGGACAT

说明在测序结果的发夹结构中，干扰序列正确。其干扰序列峰形图（图2）均为单峰，无突变。

图2 重组克隆基因测序图

2.2 慢病毒载体的包装及滴度测定 将GV248-KCTD10-RNAi载体、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体共转染入293T细胞，48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，可观察到明显的绿色荧光表达（图3）。即说明GV248-KCTD10-shRNA慢病毒载体已成功构建。用浓缩好的病毒溶液再转染293T细胞，4d后测定病毒滴度为5×108TU/mL。

图3 共转染293T细胞48 h后的荧光观察（10×）

3 讨论

KCTD10基因最早是从大鼠中被克隆出来且被鉴定为PDIP1（Polymerase delta-interacting protein 1）家族的一员，与其他家族成员一样，KCTD10的N端具有一个BTB/POZ结构域和一个钾通道四聚体化（K-tetra）结构域，这些结构域可能介导KCTD10与其他蛋白的相互作用，细胞骨架调控染色质重塑等过程［8-9］。其C端则具有一个增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）结合模体，PCNA通过其与KCTD10发生相互作用，C端还能与DNA聚合酶δ的小亚基P50相互作用，且在PCNA的作用下进一步激活DNA聚合酶δ的活性，从而发挥其在DNA复制、修复、周期调控等方面的作用［8，10］。PDIP1能被TNFα以及IL-6诱导表达［11］，相似的是，KCTD10也能被诱导表达，并随着TNFα的诱导其表达水平较其他家族成员上升显著［10］。玻璃体中IL-6的表达水平增高与PDR显著相关［12］，TNFα在DR过程中也发挥着重要的作用，它还能够通过抑制视网膜的保护基因IGFBP-3的表达从而促进DR的发展［13-15］。研究表明，KCTD10在心脏发育中有重要的作用，其纯合敲除鼠在胚胎时期表现出血管生成减少，直接导致胚胎死亡，KCTD10还能以剂量依赖性被VEGF反馈调控［5］。而在DR的发生过程中，微血管系统与VEGF均发挥着重要作用［3］。综上所述，KCTD10可能在DR的发展中有重要作用。

慢病毒是近年来应用越来越广泛的载体，具有感染效率高、容纳外源性基因片段大、表达稳定及低免疫源性等特点，是一种理想的体外基因运输工具。慢病毒载体系统由GV248载体、pHelper1.0载体和 pHelper2.0载体组成。GV248载体中含有HIV的逆转录、包装、整合元件以及辅助元件，并带有GFP作为报告基因和puro抗性基团作为抗性标记，用于观察目的蛋白表达情况和筛选稳定感染的细胞株。pHelper1.0载体中含编码病毒主要的结构蛋白、特异性的酶及相关调节因子的基因。pHelper2.0载体中含有提供病毒包装所需要的包膜蛋白的基因。病毒包装时，将这三种病毒包装质粒共转染入包装细胞293T，各载体产生病毒各组成蛋白，并包装成病毒颗粒，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可直接用于宿主细胞的感染，也可进一步浓缩，分装冻存于-80℃。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）通常是一段长21个核苷酸的双股RNA（dsRNA），其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸，每一股各有一个5'磷酸基末端与一个3'羟基末端，被dicer的酶切割较长的双股RNA或小发夹RNA（small hairpin RNA）而得。因此可利用经过适当剪裁的siRNA互补性，来对已知序列的基因进行标定，使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。

PCR阳性克隆测序结果表明，KCTD10基因成功插入GV248载体并重组为慢病毒载体GV248-KCTD10-RNAi。采用lipofectamine2000介导将GV248-KCTD10-RNAi质粒与病毒包装辅助质粒共转染293T细胞，并在其中观测到大量绿色荧光蛋白的表达，证明成功构建了KCTD10-shRNA慢病毒载体，并收获了KCTD10慢病毒颗粒。为今后进一步研究干扰KCTD10基因的表达对DR的发展过程的影响打下了坚实的基础。

参考文献

［1］ Khan ZA, Chakrabarti S. Growth factors in proliferative diabetic retinopathy［J］. Exp Diabesity Res, 2003, (4): 287-301.

［2］ Boelter MC, Gross JL, Canani LH, et al. Proliferative diabetic retinopathy is associated with microalbuminuria in patients with type 2 diabetes ［J］. Braz J Med Biol Res, 2006, 39(8): 1033-1039.

［3］ Simo R, Carrasco E, Garcia-Ramirez M, et al. Angiogenic and antiangiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy［J］. Curr Diabetes Rev, 2006, 2(1): 71-98.

［4］ Hu X, Gan S, Xie G, et al. KCTD10 is critical for heart and blood vessel development of zebrafish［J］. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2014, 46(5): 377-386.

［5］ Ren K, Yuan J, Yang M, et al. KCTD10 is involved in the cardiovascular system and Notch signaling during early embryonic development［J］. PLoS One, 2014, 9(11): e112275.

［6］ Tong X, Zu Y, Li Z, et al. Kctd10 regulates heart morphogenesis by repressing the transcriptional activity of Tbx5a in zebrafish［J］. Nat Commun, 2014, 5: 3153.

［7］ Restrepo NA, Spencer KL, Goodloe R, et al. Genetic determinants of age-related macular degeneration in diverse populations from the PAGE study［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2014, 55(11): 6839-6850.

［8］ Zhou J, Hu X, Xiong X, et al. Cloning of two rat PDIP1 related genes and their interactions with proliferating cell nuclear antigen［J］. J Exp Zool A Comp Exp Biol, 2005, 303(3): 227-240.

［9］ Zhou J, Ren K, Liu X, et al. A novel PDIP1-related protein, KCTD10, that interacts with proliferating cell nuclear antigen and DNA polymerase delta［J］. Biochim Biophys Acta, 2005, 1729(3): 200-203.

［10］ 任凯群. KCTD10基因的功能研究［D］. 南京大学, 2011.

［11］ He H, Tan CK, Downey KM, et al. A tumor necrosis factor alpha- and interleukin 6-inducible protein that interacts with the small subunit of DNA polymerase delta and proliferating cell nuclear antigen［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(21): 11979-11984.

［12］ Koskela UE, Kuusisto SM, Nissinen AE, et al. High vitreous concentration of IL-6 and IL-8, but not of adhesion molecules in relation to plasma concentrations in proliferative diabetic retinopathy［J］. Ophthalmic Res, 2013, 49(2): 108-114.

［13］ Costagliola C, Romano V, De Tollis M, et al. TNF-alpha levels in tears: a novel biomarker to assess the degree of diabetic retinopathy［J］. Mediators Inflamm, 2013, 2013: 629529.

［14］ Huang H, Gandhi JK, Zhong X, et al. TNFalpha is required for late BRB breakdown in diabetic retinopathy, and its inhibition prevents leukostasis and protects vessels and neurons from apoptosis. ［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011, 52(3): 1336-1344.

［15］ Zhang Q, Soderland D, Steinle JJ. TNFalpha inhibits IGFBP-3 through activation of p38alpha and casein kinase 2 in human retinal endothelial cells ［J］. PLoS One, 2014, 9(7): e103578.

Construction of the siRNA lentiviral Vector for targeting KCTD10 gene

Feng Yun1, Zhang Min1, Peng Wen-ting2, Li Ying-rong2, Yang Qian2, Jiang Le-long2, Wang Guang-wei2
(1. Department of Ophthalmology, Changsha Central Hospital, Changsha 410004, China; 2. Hunan University of Medicine, Huaihua 418000, China)

Objective To construct KCTD10 interference lentiviral vectors. Methods KCTD10 interference sequence was synthesized to build GV248-KCTD10-RNAi lentivirus vectors, PCR and DNA sequencing were used to identify the positive clones. KCTD10 lentivirus vectors were cotransfected with pHelper 1.0 and pHelper 2.0 vectors into 293T cells, and viral particles were produced and released from 293Tcells, then viral titer was detected. Results GV248-KCTD10-RNAi virus carrier are successfully connected and transformed. the sequencing results was consistent with the design of the sequence; Harvested the viral particles with a viral titer of 5×108 TU/ml after cotransfection. Conclusion The interference lentivirus particles of KCTD10 was packaged successfully, which laid a foundation for further study on the functions of KCTD10 gene in diabetic retinopathy.

diabetic retinopathy; KCTD10; lentiviral vector; RNA interference

R587.2；R774.1

A

1673-016X（2017）02-0009-04

2016-12-02

湖南省自然科学基金项目（No.2015JJ4036）；湖南省教育厅科研重点项目（15A134）

王光伟，E-mail:wanggwwmq323@163.com