豆粕多糖的酶法提取工艺研究

范文奇，要志宏，申丽媛，聂相珍，李波

(扬州大学 旅游烹饪学院，江苏 扬州 225127)

豆粕多糖的酶法提取工艺研究

范文奇，要志宏，申丽媛，聂相珍，李波

(扬州大学 旅游烹饪学院，江苏 扬州 225127)

试验利用纤维素酶提取豆粕多糖，并利用苯酚-硫酸法测定样品中多糖的含量，选取料液比、酶解温度、酶解时间、pH值、纤维素酶添加量为试验条件，通过试验确定单因素的最佳试验条件，同时在单因素试验的基础上进行正交试验，确定最佳试验组合。两次试验结果显示：酶法提取豆粕多糖的最适试验条件为酶解时间90 min，酶解温度60 ℃，pH 5.0，纤维素酶添加量1.0%，料液比1∶20，多糖得率达到14.92%。

提取工艺；豆粕多糖；纤维素酶；苯酚-硫酸法

大豆多糖类物质具有膳食纤维的特性，对增进人体健康有极大作用[1]；在肉制品、米面食品、酸性饮料中也有广泛应用[2]。在水产品中添加豆粕作为饲料，可产生对人体相同的生理作用[3]；豆粕发酵后，其蛋白酶的酶活力显著提高[4]。豆粕的生产利用率低，进行多糖提取是其加工的好去处。大豆多糖的提取工艺，常用水、稀酸和稀碱作为提取剂，或采取膜过滤法。常规方法可能导致浸提剂与豆粕多糖发生反应，降低其得率[5]。本文所用的酶法提取的优势显著，使多糖物质更易溶出，再加上水浴提取的试验方法，酶法提取的优势显著，在其他原料提取多糖的办法中也是较好的选择。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄糖标准溶液(称取一定量的葡萄糖放于铝盒中，在105 ℃的鼓风干燥箱中干燥3 h至恒重，取出后置于干燥器中，待温度下降，准确称取1.000 g葡萄糖于1 L容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀)；纤维素酶(酶活力50000 U/g，江苏锐阳生物科技有限公司)；6 mol/L盐酸溶液；2 mol/L氢氧化钠溶液；6%的苯酚溶液；98%的浓硫酸；豆粕(来源于山西农业大学晨曦市场)；蒸馏水。

1.2 设备和仪器

FZ102型微型植物粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；OZKW-S-4型电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；2100型分光光度计 尤尼柯仪器有限公司；离心机 北京雷勃尔离心机有限公司；60目筛、DHG-9243BS-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；广泛pH试纸、精密试纸pH 0.5～5.0 镇江市化剂厂；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

豆粕粉→加蒸馏水溶解→添加纤维素酶→水浴浸提→离心分离取上清液→调节pH值沉淀蛋白→离心分离取上清液→大豆多糖水溶液[6]。

1.3.2 试验测定原理

糖类物质与浓硫酸作用脱水，生成糠醛或糠醛衍生物，糠醛及其衍生物进一步与苯酚反应，生成黄橙色的有色物质，在不同浓度下，颜色深浅不一，而其吸收值与糖浓度会呈现线性关系[7，8]，故可以准确得到多糖得率。

1.3.3 葡萄糖标准曲线的绘制

分别取葡萄糖标准溶液0,2,4,6,8,10 mL至6个100 mL容量瓶中，进行定容。6种浓度的溶液作为葡萄糖用液，之后各取1 mL溶液于6个试管中，加入6%苯酚溶液1.0 mL，再快速加入浓硫酸5.0 mL，轻微振荡试管，使试管内溶液颜色均匀，将6个试管置于试管架中静置10 min，静置结束之后，轻微移动试管，防止再次产生振荡，然后在490 nm处测吸光度[9]，记录数值，绘制图表。

1.3.4 样品的测定

试验得到的是澄清的黄色溶液，取试验得到的样液1 mL，溶解于500 mL蒸馏水中，再取稀释后的溶液1 mL于试管中，加入6%苯酚溶液，同时加入5 mL浓硫酸，轻微振荡试管，使试管内溶液颜色一致，然后放置于试管架中静置10 min，同时配制好空白试验，静置结束后在490 nm处测吸光度，记录数值，若数值偏高，或直接在溶液反应时已觉察在试管中的液体颜色较深，可重新取样液，并提高稀释倍数，并重新测量，每次测定应做3组重复试验。

1.3.5 计算多糖得率

多糖得率=(a·b/c)×100%。

式中：a为利用标准曲线求得的葡萄糖质量(μg)，b为浸提处理液的稀释倍数，c为称取的豆粕质量(μg)。

1.4 单因素试验的操作步骤

1.4.1 料液比的选择

分别取5个锥形瓶，编号1～5号，分别加入10 g豆粕粉，再加入豆粕粉质量1.0%的纤维素酶，然后分别加入100，150，200，250，300 mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌充分混合。之后调节pH为5.0，然后放于60 ℃的水浴锅中浸提90 min，水浴锅中的页面应超过锥形瓶中的液面，每个锥形瓶用棉塞封口，并且水浴锅应加盖，时间计时从温度稳定开始，在浸提过程中应每隔一段时间摇匀锥形瓶，充分提取豆粕中的多糖。反应结束后，取出锥形瓶静置一段时间，使不溶解的部分沉于瓶底，转移至离心管时，轻微倾斜至锥形瓶中只剩下不溶解成分，之后在3500 r/min的条件下离心10 min，取出后转移上清液至烧杯中，调节pH至4.5，使蛋白质完全沉淀，在上述条件下再次离心，如若得出的溶液仍有白色絮状物存在，应再次调节pH，并重新在相同条件下离心，此时得到的上清液为可溶性大豆多糖的水溶液，进行多糖得率的测定，记录数值。

1.4.2 酶添加量的选择

纤维素酶添加万分之一即可起作用，所以在这个基础上选择单因素。分别取5个锥形瓶，编号1～5号，各加入10 g豆粕粉，然后分别加入0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%豆粕粉质量的纤维素酶，各加入200 mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌充分混合，调节pH为5.0。然后在60 ℃的条件下水浴浸提90 min，浸提结束后将三角瓶中的溶解部分在3500 r/min的条件下离心10 min，取出后转移上清液到烧杯中调节pH至4.5，沉淀豆粕中的蛋白，在相同条件下再次离心，如若得到的溶液不是非常澄清、有絮状物，重复交接pH的步骤，最后得到的澄清液为豆粕多糖的水溶液，进行多糖得率的测定，记录数值。

1.4.3 酶解pH的选择

在编号1～5号的锥形瓶中加入10 g豆粕粉，再加入豆粕粉质量1.0%的纤维素酶，之后加入200 mL蒸馏水，搅拌充分混合，按从小到大的顺序依次调节pH为3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，放于60 ℃的水浴锅中浸提90 min，水浴锅液面超过锥形瓶液面，并且水浴锅加盖。浸提结束后，调节离心机的转速为3500 r/min，将锥形瓶中溶解部分离心10 min，之后将离心澄清的溶液转移到烧杯中，调节pH至4.5，初始pH条件为4.5的3号管也应重新调节pH，使蛋白质完全沉淀，在相同条件下再次离心，如若仍有絮状物出现在离心管中，应重复调节pH的步骤，最终得到的澄清溶液为豆粕多糖的水溶液，按照样品的测定步骤进行多糖得率的测定，记录吸光度值。

1.4.4 酶解时间的选择

在编号1～5号的锥形瓶中加入10 g豆粕粉，再加入豆粕粉质量1.0%的纤维素酶，之后加入200 mL水，搅拌充分混合，调节pH为5.0，在60 ℃的温度条件下进行水浴浸提，浸提时间按从小到大的顺序依次为30，60，90，120，150 min，浸提结束后，调节离心机的转速为3500 r/min，将溶解部分离心10 min，结束后转移上清液至5个烧杯中调节pH至4.5，使蛋白质完全沉淀，然后在相同条件下再次离心，如若仍有白色絮状物出现，重复调节pH的步骤，最后得到的澄清液为豆粕多糖的水溶液，按照样品测定的步骤进行多糖得率的测定，记录吸光度值。

1.4.5 酶解温度的选择

在5个相同的锥形瓶中，加入10 g豆粕粉，加入豆粕粉质量1.0%的纤维素酶，再加入200 mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌充分溶解，将锥形瓶编号1～5号，调节水浴锅的温度条件依次为50，60,70,80,90 ℃，同时按照从小到大的顺序对豆粕进行浸提，浸提结束后，将溶解部分在3500 r/min的条件下离心10 min，离心结束后转移上清液于烧杯中调节pH至4.5，使蛋白质完全沉淀，在相同条件下离心分离取上清液，如若仍有白色絮状物出现，重复调节pH的步骤，最后得到的澄清液为豆粕多糖的水溶液，按照样品测定的步骤进行多糖得率的测定，记录吸光度值。

1.5 正交试验

根据单因素试验，选择温度、时间、pH值和添加量为4个因素，对应的3个提取率较高的试验条件为水平进行正交试验，因素与水平见表1。

表1 正交因素与水平

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 不同料液比对试验结果的影响

图2 不同料液比对试验结果的影响

由图2可知，料液比较优水平为1∶20。

2.2.2 不同的酶添加量对试验结果的影响

图3 不同的酶添加量对试验结果的影响

纤维素酶添加万分之一即可起作用[10]，所以在这个基础上选择单因素。由图3可知，多糖得率逐渐升高，在1.0%处达到多糖得率的最大值，继续添加纤维素酶，可能会使纤维素酶分解溶解出的多糖，使部分多糖和糖苷遭到破坏，降低多糖得率，故选择酶添加量为1.0%。

2.2.3 不同pH值对试验结果的影响

图4 不同pH值对试验结果的影响

由图4可知，纤维素酶发挥最大作用的pH值在4～6之间[11]，故选择pH值为3.5～6.0的因素选择。试验结果依次为10.65%，12.25%，13.85%，14.49%，12.89%。在pH值为3.5时，酶未能发挥良好作用，多糖得率仅为10.65%，而从pH值为4开始，曲线呈明显的上升趋势，直至pH值为5附近时，到达顶点，而后随着远离最适条件，结果呈下降趋势，但因试验条件的限制，不能测得pH值为5.5的结果，但通过图4仍可反映出适宜酶解pH值在5附近，故选择酶解pH值为5.0。

2.2.4 不同的酶解时间对试验结果的影响

为了体现出时间因素对试验结果的影响，选择了间距较宽的时间段，这可以反映出时间对结果影响的趋势。

图5 不同的酶解时间对试验结果的影响

由图5可知，在较短的时间里，酶不足以完全反应，多糖没有完全溶解，反应进行到90 min乃至更久时，多糖得率已经趋于平衡，纤维素酶作用不再明显。综合考虑，选择最佳酶解时间为90 min。

2.2.5 不同反应温度对试验结果的影响

图6 不同反应温度对试验结果的影响

由图6可知，纤维素酶的酶解温度在50～70 ℃之间[12]。60 ℃时酶活性最高，在高温时酶活力下降，会出现不可逆转的特性，使得在90 ℃时，多糖得率比较低温度时更低。

2.3 正交试验结果与分析

表2 正交试验结果

续 表

由表2可知，4个单因素对多糖得率的影响程度不同，从大到小依次为酶解温度、pH值、酶解时间、酶添加量。正交试验最佳试验因素为A2B2C3D1。由于不同酶添加量对试验的影响最小，而在单因素试验中，1.0%的酶添加量效果优于0.8%的酶添加量，而正交试验没有更优的试验条件，故应该选择验证试验，试验条件为酶解温度60 ℃，酶解时间90 min，pH值5.0，酶添加量1.0%，试验结果为14.92%，略高于优选组合，则应该选择验证试验的试验条件为最佳条件。

3 结论

综合单因素和正交试验的结果，通过纤维素酶提取豆粕多糖的最适试验条件为酶解温度60 ℃，酶解时间90 min，pH值5.0，酶添加量1.0%，料液比为1∶20，多糖得率可以达到14.92%。本试验通过对大豆生产的副产品豆粕的更加深层次的应用，为大豆多糖提取提供了更好的途径。

[1]张树和,韩羿斌,金双喜,等.大豆多糖对双歧杆菌及人肠道菌群生长的影响[J].中国微生态学杂志,2008(2):135-136.

[2]杨晓泉,齐军茹,司华静,等.大豆多糖的研究进展及在含乳饮料、米面等食品上的应用[J].中国食品添加剂,2008(3):135-139.

[3]王崇,雷武,解绶启,等.饲料中豆粕替代鱼粉蛋白对异育银鲫生长、代谢及免疫功能的影响[J].水生生物学报,2009(4):740-747.

[4]吴晖,卓林霞,解检清,等.发酵条件对枯草芽孢杆菌发酵豆粕中的蛋白酶活力的影响[J].现代食品科技,2008,24(10):973-976.

[5]孟岳成,邱蓉,张学兵.碱法提取可溶性大豆多糖的工艺[J].食品研究与开发,2009,30(11):83-86.

[6]代增英,高克栋,冯建岭,等.豆粕中多糖提取工艺的研究[J].中国调味品,2014，39(1):37-40.

[7]张水华.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社, 2013.

[8]姜琼,谢妤.苯酚-硫酸法测定多糖方法的改进[J].江苏农业科学,2013,41(12):316-318.

[9]王琳,刘国生,王林嵩,等.DNS法测定纤维素酶活力最适条件研究[J].河南师范大学学报(自然科学版),1998(3):69-72.

[10]F Saura-Calixto, A García-Alonso, I Goni, et al. In vitro determination of the indigestible fraction in foods: an alternative to dietary fiber analysis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48(8):3342-3347.

[11]谭永辉.水溶性大豆多糖的高效提取及改性研究[D].北京：中国农业科学院,2008.

Study on the Enzymatic Extraction Process of Polysaccharides from Bean Pulp

FAN Wen-qi,YAO Zhi-hong,SHEN Li-yuan,NIE Xiang-zhen,LI Bo

(School of Tourism and Culinary Science, Yangzhou University, Yangzhou 225127,China)

Use cellulase to extract bean pulp polysaccharides, and then adopt phenol-sulfuric acid method to determine the content of bean pulp polysaccharides.Choose the ratio of solid to liquid, enzymatic temperature, enzymatic time, pH, cellulase amount as experimental conditions, and on the basis of single factor experiment, use orthogonal experiment to determine the optimum combination of factors. The experimental results show that the optimum experimental conditions for bean pulp polysaccharides are enzymatic reaction time of 90 min, enzymatic temperature of 60 ℃, pH of 5.0, cellulase amount of 1.0%, the ratio of solid to liquid of 1∶20, the polysaccharides extraction rate reaches 14.92%.Key words: extraction process; bean pulp polysaccharides; cellulase; phenol-sulfuric acid method

2016-11-14

范文奇(1994-)，男，山西晋城人，硕士，研究方向：食物成分与人体健康。

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.014

1000-9973(2017)05-0065-04