酶水解哈氏仿对虾蛋白提高咸味的研究

王欣，安灿，陈美龄，缪文华，罗成，邓尚贵

(浙江海洋大学 食品与医药学院，浙江 舟山 316022)

酶水解哈氏仿对虾蛋白提高咸味的研究

王欣，安灿，陈美龄，缪文华，罗成，邓尚贵*

(浙江海洋大学 食品与医药学院，浙江 舟山 316022)

咸味是人类主要的味觉之一，是控制机体生理平衡最重要的因素之一。然而由于味觉的需要，人类食用盐量普遍高于真正所需的量。为了研究水解海洋蛋白产生咸味肽，以便于开发适合于高血压病人所需的无钠调味剂。根据国标GB/T 12135-2008感官分析方法，该研究建立了NaCl感官评定标准曲线，以用于咸味肽对应食盐浓度的感官评估。根据木瓜蛋白酶选择性水解疏水氨基酸的特性，使用0.1%木瓜蛋白酶能使哈氏仿对虾蛋白在0～2.5 h咸度从10 mmol/L提高到35 mmol/L，但仍保留多数哈氏仿对虾20 kDa主蛋白及以下的蛋白。为了提高蛋白水解度以及提高咸度的可能性，使用1%的中性蛋白酶与木瓜蛋白酶双酶，双酶水解在0～2.5 h几乎所有蛋白都被消化，咸度由10 mmol/L提高到55 mmol/L，这些实验表明木瓜蛋白酶与中性蛋白酶一旦协同结合，既可充分地水解蛋白，也可释放更多的咸味肽。而随后咸味的下降应该是进一步水解成单氨酸，这些为咸味肽的工艺设计等提供了重要参考。

哈氏仿对虾；感官评定标准；双酶水解；咸味肽；木瓜蛋白酶；中性蛋白酶

食盐(NaCl)所产生的咸味不仅可以改善人们的食欲，更重要的是，有调节人体机体体液和电解质平衡以及体温的平衡等重要功能。然而据世界卫生组织的统计资料，人类食用盐普遍高于生理的实际需求。高盐引起细胞及血管渗透作用异常，通常导致Ⅱ型糖尿病、高血压及不同的心血管疾病[1,2]。为了保持同样的食盐咸度，而又能减少食用的食盐量一直是食品科学的使命。目前世界卫生组织(WHO)建议的盐摄入量为6 g/天/成人(70 kg)， 但我国人群实际上的盐摄入量超过10 g[3]，如北京地区人日均食盐摄入量为16～18 g，高血压发生率为9.5/万人；而广东地区人日均食盐摄入量为6～7 g，高血压发生率仅为2.5/万人[4,5]。为了减少食盐摄入量，最有效的方法是减少Na+的摄入，而又能保持食品咸味。目前我国市场上有各种各样的低钠 (比如KCl替代部分NaCl)调味剂，但或是缺乏营养，或实质上是碱性添加物。

当过量食盐，血管中盐浓度过高，血管中的水分就会增加，血容量增加，同时细胞内外钠离子水平的增加可导致细胞水肿，血管平滑肌细胞肿胀，血管腔狭窄，外周血管阻力增大，进而导致血管壁受到的压力增强，最终使血压升高，此外，盐也可加重心脏、肾脏的负担，所有这些原因都可能使高盐导致各种心血管疾病[6]。咸味肽最早是Tada等于1984年在对酪蛋白水解物BPla(Arg-G1y-Pro-Pro-Phe-lle-Val)的N端类似物的合成过程中偶然发现的。因为这些肽除了鲜味，也有咸味。接着他们又通过合成发现了几种呈咸味的二肽，其中L-Orn-β-Ala. HCl和L-Orn-Tau. HCl有着与NaCl相同甚至比NaCl咸味更强的味[7]。Seki于1990年研究了咸味二肽Orn-β-Ala的理化性质，发现二肽的咸味与氨基的解离程度以及是否有相对离子有关。Seki等进一步研究认为多肽溶液的pH值与呈咸味的特性有很大关系[8]。

最近几年从不同的蛋白酶水解短肽中发现，酶水解短肽，特别是鱼精蛋白、奶蛋白，各种动物肉蛋白的咸味增加明显，而大米、豌豆蛋白的水解肽几乎不产生任何咸味[9]，主要是由于前者包含大量L-赖氨酸和L-精氨酸，虽然其机理尚不完全清楚，但这些短肽特别是二肽所提高的咸味不增加苦味，非常适合于糖尿病(Ⅱ型)人或高血压病人提供高营养的无钠咸味剂[10,11]。所以研究咸味肽，特别是从海洋渔业资源中寻找咸味肽，将有助于水产品的深加工。哈氏仿对虾是舟山沿海重要的经济虾，价格低廉[12]，因而极有可能成为寻找咸味肽的良好材料。

1 材料与方法

1.1 材料

自然捕捞的哈氏仿对虾[Parapenaeopsishardwickii(Miers)]：购买于舟山超市，由浙江海洋大学老师对哈氏仿对虾进行鉴定；牡蛎蛋白肽：用作水解蛋白对照，青岛东易科技发展有限公司；中性蛋白酶(EC 3.4.24.4)：50 U/mg，酶活≥50 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；木瓜蛋白酶(EC 3.4.22.2)：级别为BR，酶活力为800000 U/g，上海研域生物工程有限公司；小牛血清白蛋白(BSA)：级别为BR，USA Sigma公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HZ-8812S-型电子恒温振荡器 常州诺基仪器有限公司；Bio-Rad 酶标仪 伯乐生命医学产品(上海)有限公司；Delta 320 pH 计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；TGL-20M 台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；DS-1 高速组织捣碎机 上海精密仪器仪表有限公司；HH-S 型水浴锅，85-2 型恒温磁力搅拌器 巩义市英峪予华仪器厂；DHL-A 恒流泵，HD-3 紫外检测仪，HD-A电脑采集器 上海泸西分析仪器厂；AY120型分析天平；Himac CF 16RX离心机 日立公司。

1.3 方法

1.3.1 咸味感官标准曲线的制备

首先利用无离子水及58.5 g食盐(浙江禄海制盐有限公司)制备1 mol/L NaCl，然后稀释配成10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100 mmol/L。对每种浓度根据国标GB/T 12135-2008感官分析方法：排序法及Friedman检验法进行评定[13]。即随机利用连续3个浓度单盲正确地判断出低、中、高浓度的测试者，测出其余的感官NaCl 浓度，并做出NaCl的感官标准曲线，用此曲线在测试人中形成自身的咸味刻度来测试未知咸度的对应食盐浓度。

哈氏仿对虾购买于舟山超市，酶解前保存于冰的环境。酶解条件：去离子水清洗后，经去壳、称重100 g，按 1∶5的蛋白质量比加入0.01×PBS缓冲液，在DS-1高速组织捣碎机上打浆5～10 min，分别加入0.1%的木瓜蛋白酶、1%的中性蛋白酶与木瓜蛋白酶双酶，混合搅拌均匀，置于 50 ℃水浴锅中，酶解过程中的pH不做调整(以防止引入盐离子干扰咸度的鉴定)，酶解4 h；每0.5 h取样1次，取样后置于95 ℃水浴锅中，灭酶15 min，冷却，定容，12000 r/min离心10 min，取上清液备用。在水解过程中按设计的时间点进行取样和感官评定。

1.3.2 虾蛋白酶水解与咸度测定

哈氏仿对虾经过匀浆后，以1∶5与0.01×PBS缓冲液稀释，然后以蛋白样品0.1%的木瓜蛋白酶，或者1%的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶双酶的酶量在50 ℃进行酶消化。对0.01%的木瓜蛋白酶酶解消化后，每30 min取样1次，当场测量感官咸度，取得样品用于SDS-PAGE样品；对1%双酶水解消化后，10 min 取样1次，接下来每30 min取样1次，当场测量感官咸度，取得样品用于SDS-PAGE样品。

1.3.3 Bradford 蛋白浓度测定

考马斯亮蓝G-250(1 g)，溶于50 mL 95%酒精，最后用无离子水定容到1000 mL。在96孔平板，按180 μL G-250+20 μL 设置，在595 mmol/L 波长使用Bio-Rad酶标仪测定其OD值。

1.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳

由于是2肽、3肽、寡肽，产生咸度更高，所以需展示可控的消化蛋白的变化过程。按照Bio-Rad方法配制5%的浓缩胶、15%的分离胶。SDS-PAGE凝胶电泳酶水解样品，80 V，4 h。凝胶经过考马斯亮蓝R-250进行染色1 h后进行脱色，脱色约8 h后进行照相。利用Photoshop(Adobe 6.0)捕捉蛋白带灰度值，并使用微软Excel(2010专业版)计算出相对蛋白浓度。

1.3.5 数据与统计分析

每个实验重复至少3次，实验数据用x±s表示，采用t检验对各组变异性进行统计分析。以P<0.05表示有统计学意义。数据采用Excel(2010专业版)分析，做图。

2 结果与分析

2.1 盐咸度的感官评定曲线

由于缺乏真正的仪器测量咸度，故采用感官评价方法。根据文献[9]，50 mmol/L的NaCl最接近肉汤的咸度。感官标准曲线感官浓度低于实际NaCl浓度 (R2=0.9921)，可能是溶解度带来的误差，也包括感官的不敏感带来的系统误差，见图1。

图1 食盐(NaCl)感官曲线

注：误差棒表示其标准误差。

虽然检测NaCl有专门的国标法 GB/T 12457-2008，但不可能用于非NaCl 咸味剂的测定，而只能有感官评定法。人的感觉器官是非常精密的“生物检测器”，它可以检测到用化学分析仪器无法检测到的微量成分，测试人是在校大学生和研究生，其测试阈值是5～10 mmol/L NaCl。利用高、中、低的单盲测试结果，或作者通过自己建立起的记忆感官标准曲线，可相对精准地评定出对应的NaCl 浓度，这一标准曲线被始终用在这一研究中，以用作酶水解蛋白不同时间点对应的NaCl浓度与咸度的参照。

2.2 酶水解哈氏仿对虾蛋白

酶水解前后总蛋白浓度变化利用考马斯亮蓝G-250在595 mmol/L对蛋白有吸收，蛋白标准曲线按照Bio-Rad公司提供方法进行，通过酶标仪的OD值及蛋白标准曲线换算出蛋白量。蛋白量从未消化时的0.92 mg/mL到3 h消化后的0.63 mg/mL，蛋白的降解趋于稳定，0.1%木瓜蛋白酶水解的蛋白(总)浓度的变化进程见图2，即蛋白浓度的变化会反映水解的程度。

图2 Bradford 法测定木瓜蛋白酶水解(0.1%)前后蛋白浓度

2.3 SDS-PAGE检测0.1%木瓜蛋白酶水解蛋白及咸味变化的感官评定

图3 木瓜蛋白酶(0.1%)水解哈氏仿对虾蛋白咸味的提高

注：A为SDS-PAGE 展示的 3 h的蛋白消化；带1为蛋白标准；2为未经酶解的蛋白CK，3～8为0.1% 的木瓜蛋白酶水解的鱼蛋白，依次为30'，60'，90'，120'，180' 的酶水解；B为对应的水解过程的咸味变化。

由图3中A可知，0.1%的木瓜蛋白酶水解哈氏仿对虾后的蛋白分布，大多数20 kDa位置的蛋白明显未被水解，这个情况应该与木瓜蛋白酶的选择性切割蛋白肽的特征有关系，木瓜蛋白酶选择性切割疏水性氨基酸如赖氨酸、精氨酸等。由图3中B可知，其咸度从10 mmol/L增加到2.5 h 的最高咸度35 mmol/L，随后咸度下降，但没有产生其他味道，一方面应该是酶量有限，不能水解更多的蛋白 (见图3中A)，另一方面很有可能也受酶与蛋白的3D 空间影响，所以无3D 空间障碍的寡肽则会被继续降解，所以造成咸度下降，这说明虽然木瓜蛋白酶的选择性切割蛋白肽的特征导致水解不完全，但是其仍具有提高咸度的潜力。

2.4 SDS-PAGE 检测双酶水解蛋白及咸味变化的感官评定

图4 木瓜蛋白酶与中性酶双酶(1%)水解哈氏仿对虾蛋白咸味的提高

注：A为SDS-PAGE 展示的10'～3 h的蛋白消化；带1为蛋白标准；2为未经酶解的蛋白CK；3～9为1% 的双酶水解的鱼蛋白，依次为 10'，30'，60'，90'，120'，180' 的酶水解；B为水解过程的咸味变化。

由图4中A可知，1%的中性蛋白酶与木瓜蛋白酶双酶水解3 h可以基本全部消化哈氏仿对虾的所有蛋白。由图4中B可知，其咸度从10 mmol/L增加到2.5 h的最高咸度55 mmol/L，咸度增加幅度大，咸味明显提升，在这个时间的咸味肽产生量最多，根据这一结果，我们可以选择在酶解2.5 h时进行灭酶，然后分离提纯，获取最终的咸味肽。而随后咸度下降，咸味中夹杂苦涩味和甜味以及鲜味等，中性蛋白酶的水解产生了苦味肽、甜味肽以及鲜味肽等，这有可能是中性酶水解蛋白导致单氨基酸所产生的原因。

3 结论

肽优于蛋白质允许更快地与水吸附，咸味肽的发现有利于海洋水产品的深加工，提高经济效益，更主要的是有助于降低NaCl的摄入量，向高血压病人提供无钠咸味剂，从而降低高血压、Ⅱ型糖尿病及其并发症的风险。

使用0.1%木瓜蛋白酶单酶水解咸度从10 mmol/L增加到35 mmol/L，这很有可能也受酶与蛋白的3D空间影响，从而无3D空间障碍的寡肽则会被继续降解，从而造成咸度下降。而使用各自1%的木瓜蛋白酶及中性蛋白酶双酶水解，咸度从10 mmol/L增加到 55 mmol/L，这应该由于结合了双酶的优势，因为中性蛋白酶是随机水解任何蛋白中的任何肽键，而木瓜蛋白酶则只选择性地切割咸味相关的肽，这既帮助了虾蛋白的加快水解，也保证精氨酸、赖氨酸二肽的形成，提高了更多咸味肽的产生，当然咸味肽需要有一定的二肽结构。随着蛋白或者肽的深度酶解，二肽也将被水解成单氨基酸，这很可能是水解2.5 h后咸度反而下降的原因。

这些结果为有效地生产具有咸味的精氨酰二肽，在工业化过程中可能需要的消化及控制条件等的设计提供基本信息，以积累更多产品。

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[13]GB/T 12135-2008，感官分析方法：排序法[S].

Enzymatic Hydrolysis of Parapenaeopsis hardwickii(Miers) Protein for Enhancing Saltiness

WANG Xin, AN Can, CHEN Mei-ling, MIAO Wen-hua, LUO Cheng, DENG Shang-gui*

(School of Food and Medicine, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022,China)

Saltiness is one of the basic tastes and plays a key role in human physiological balance. The adverse effects of excessive salt intake have forced the food industry to seek alternatives to reduce salt content in food while maintaining sufficient saltiness. This study is to develop salty peptides from enzymatically hydrolyzed shrimp proteins, aiming for type 2 diabetes and high blood pressure patients. According to the standard GB/T 12135-2008 sensory evaluation method, a standard curve plotting salinity against salt (NaCl) concentration is established, which is used for the saltiness evaluation of fish peptides. Since papains selectively hydrolyze hydrophobic amino acids, such as arginine and lysine, and they are also amino acids for salty peptides. In this study, the protein ofParapenaeopsishardwickii(Miers) is digested by 0.1% papain(EC 3.4.22.2), the salinity increases from 10 mmol/L to 35 mmol/L, but 20 kDa and lower proteins remain. In order to improve the protein hydrolysis and the salinity, 1% neutral protease and papain, double enzyme hydrolysis for 2.5 h, almost all of these proteins can be digested, salinity increases from 10 mmol/L to 55 mmol/L. The experimental results show that papain and neutral protease is a synergistic combination, can be used to fully hydrolyze protein, and generate more salty peptide. The decrease of saltiness after the peak could be the results of further hydrolysis of dipeptides. These results provide an important reference for the process design of salty peptides in industry.

Parapenaeopsishardwickii(Miers); sensory evaluation standard; double enzymes hydrolysis; salty peptides; papain; neutral protease

2016-11-16 *通讯作者

国家自然科学基金重大项目(31471609)；中国国际科技合作计划项目(2012DFA30600)

王欣(1991-)，女，江苏徐州人，硕士，研究方向：食品科学与水产品加工；

罗成(1958-)，男，教授，博士，研究方向：食品科学；

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.004

1000-9973(2017)05-0012-05

邓尚贵(1966-)，男，浙江舟山人，教授，博士，研究方向：食品科学与水产品加工。