低氟南极磷虾酶解物的制备及其营养特性评价

黄俊伟，张少敏，刘慧燕，崔春*，赵谋明

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 501641；2.广东环境保护工程职业学院 食品工程系，广东 佛山 528216)

低氟南极磷虾酶解物的制备及其营养特性评价

黄俊伟1，张少敏2，刘慧燕2，崔春1*，赵谋明1

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 501641；2.广东环境保护工程职业学院 食品工程系，广东 佛山 528216)

利用外源酶和内源酶协同酶解南极磷虾，对酶解过程中南极磷虾氟溶出规律和蛋白水解情况进行研究，以氟溶出率和蛋白回收率为指标，响应面优化酶解工艺制备低氟南极磷虾酶解物，并对其营养价值和抗氧化活性进行评价。研究结果表明：胰酶为最适外源酶，高温和酸性条件下酶解都会促进南极磷虾氟溶出，最优酶解条件为温度45 ℃，初始pH 7.5，酶解时间7 h，此时氟溶出率和蛋白回收率分别为15.52%和69.64%。南极磷虾酶解物(AKPHs)的氟含量为24.90 mg/kg，远远低于FDA安全限量标准。AKPHs相对分子质量<3000 Da的组分高达80.48%，其中1000～3000 Da和<500 Da的组分分别为47.97%和20.11%。必需氨基酸、支链氨基酸、抗氧化氨基酸、鲜甜味氨基酸和疏水性氨基酸占总氨基酸比例分别为41.18%，18.99%，8.29%，47.50%和40.37%；除缬氨酸含量略低外，其他氨基酸都符合或者超过FAO/WHO/UNU(2007)推荐的成人模式。

南极磷虾；酶解；氟；营养价值

南极磷虾是一种小型的、外形类似虾的甲壳类动物，是世界上最大的动物蛋白资源之一。南极磷虾在海水中集群分布，密度可达11.3～44.9 g·m-2，容易实现商业化捕捞。南极磷虾蛋白氨基酸组成丰富，必需氨基酸齐全，消化率高[1]。尽管近年来全球捕获量日益增长，但南极磷虾开发利用率仍偏低，远远低于其年最大允许捕获量(400×104～ 600×104t)。据报道，南极磷虾氟含量极高，全虾氟含量1102～1432 mg/kg，虾壳3828～4278 mg/kg，虾肉178～285 mg/kg[2]，比海水的氟含量(1.3 mg/kg)高出几个数量级。研究表明：摄入高含量的氟可能会导致氟骨病、氟斑牙等。考虑到南极磷虾富氟特性及其氟的高生物可给性，若直接食用南极磷虾可能会对人体有害，因此，南极磷虾主要作为饲料用于水产养殖业[3]。

为了能有效利用南极磷虾蛋白，降低其氟含量，提高其食用价值和产品附加值，国内外学者做了许多工作。机械脱壳处理可以有效回收虾肉，降低氟含量，但该法会产生大量废水，虾肉得率仅为10%～15%(以磷虾全重计)，虾肉氟含量依然高达178～285 mg/kg。磷虾可用来制作肉糜，但该法耗水多，磷虾中水溶性蛋白损失严重，蛋白回收率不高。Chen等[4]用碱溶酸沉法回收南极磷虾蛋白，得率仅为45%～50%，而且该法需要多次调节pH和离心，耗水量大，成本高；多次酸洗可降低磷虾蛋白的氟含量，但会消耗更多的水和试剂，成本更高。酶解处理是提高南极磷虾蛋白回收率的有效手段。相较于完整蛋白，酶解产物更容易被人体吸收利用。许多研究表明南极磷虾酶解产物具有抗氧化、抑制有害菌[5]、预防骨质疏松[6]、抑制ACE酶活力[7]等生理活性。

目前关于南极磷虾氟方面的文献报道大多集中在南极磷虾富氟机制研究、氟化物化学形态分析、储藏过程中南极磷虾氟迁移规律[8]、加工处理方式对其氟含量影响以及脱氟处理[9]等方面，关于南极磷虾酶解过程中氟溶出规律，尤其是通过控制酶解参数来减少酶解产物氟含量的相关研究鲜见报道。本文利用内源酶和外源酶协同酶解南极磷虾，兼顾蛋白回收率和氟溶出率，采用响应面优化工艺制备低氟南极磷虾酶解物，并对其营养价值进行评价，旨在为高附加值南极磷虾产品的工业化生产提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

冰冻南极磷虾(frozen whole krill)：青岛远洋捕捞有限公司，-20 ℃保存备用。酶制剂：胰酶 重庆市祥盛生物制药有限公司；PR23和木瓜蛋白酶 广州裕立宝生物科技公司；碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶 北京诺维信酶制剂公司；酸性蛋白酶 山东隆科特酶制剂有限公司；中性蛋白酶 广州明远生物科技有限公司。超纯水为实验室使用Milli Q超纯水仪自制。抗坏血酸、EDTA、盐酸、氢氧化钠、硫酸钾等其他化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

HYP-308消化炉、KDN-103F型微量凯氏定氮仪 上海纤检仪器有限公司；善美SM-G21型绞肉机 广州新域机电制造有限公司；电子分析天平 梅特勒-托利多国际股份有限公司；pH-3E pH计 上海雷磁仪器厂；THZ-82恒温振荡器 常州国华电器有限公司；日立L-8800型氨基酸分析仪；Waters 高效液相色谱仪 美国 Waters 公司；Milli Q超纯水仪 Merck Millipore公司；PF-202-C氟离子复合电极 上海仪电科学仪器股份有限公司；TG20-WS离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 低氟南极磷虾酶解物的制备

冰冻南极磷虾→解冻→绞成磷虾肉糜→按照原料与水1∶1的比例加入超纯水搅拌混匀→调至合适pH，加入0.1% (E/S)外源酶协同酶解→沸水浴灭酶10 min→冷却至室温→8000 r/min离心20 min→上清液过滤纸→南极磷虾水解物(AKPHs)。实验中用到的外源酶最适酶解条件如下：胰酶(50 ℃，pH 7.0)；PR23(50 ℃，pH 4.0)；碱性蛋白酶(55 ℃，pH 8.0)；酸性蛋白酶(50 ℃，pH 3.0)；风味蛋白酶(50 ℃，pH 7.0)，中性蛋白酶(50 ℃，pH 7.0)，木瓜蛋白酶(50 ℃，pH 7.0)，复合蛋白酶(50 ℃，pH 7.0)。

1.3.2 基本理化指标的测定

粗蛋白：凯氏定氮法，参照国标GB/T 5009.5-2010；水分含量：参考国标GB/T 5009.3-2010；灰分：参考国标GB 5009.4-2010；粗脂肪：Bligh & Dyer法；氟含量：氟离子选择性电极法，参照国标GB/T 5009.18-2003；总糖的测定：苯酚硫酸法。

1.3.3 蛋白回收率、水解度和氟溶出率的测定

使用凯氏定氮法测定原料和酶解液的总氮含量，甲醛滴定法测定氨氮含量，氟离子选择性电极法测定原料和酶解液的氟含量。蛋白回收率定义为酶解液中的蛋白总量占原料蛋白总量的比值；水解度定义为酶解液中的游离氨氮量占原料总蛋白氮量的比值；氟溶出率定义为酶解液中的总氟量占原料总氟量的比值。

1.3.4 肽分子量分布

参考赵强忠等[10]的方法，采用凝胶色谱法测定酶解液肽分子量分布。标准肽样品为ferritin(440000 Da)，醛缩酶(158000 Da)，牛血清蛋白(67000 Da)，细胞色素C(12384 Da)，抑肽酶(6511 Da)，VB12(1355 Da)，谷胱甘肽(307 Da)。将标准品的相对分子质量对数值与洗脱液体积进行线性拟合，得到方程y=-2.2777x+18.59(R2=0.99)，其中y为标准肽相对分子量对数值，x为洗脱体积。

1.3.5 总氨基酸组成的测定

参考GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》。取1 mL待测样于水解管中，定量加入4 mL去离子水，再加入5 mL(优级纯)浓盐酸，水解管用液氮冷却后减压封口，放在(110±1) ℃恒温干燥箱中水解22 h后取出冷却。然后过滤，取1 mL滤液挥干后加入1 mL去离子水溶解后蒸干，反复3次，最后加入4 mL pH 2.2缓冲溶液溶解后供氨基酸自动分析仪测定其氨基酸组成。

1.4 数据处理

实验结果采用Excel软件进行处理，Design Expert(Trial Version 8.0.5)进行响应面优化设计，SPSS 19.0进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 南极磷虾基本成分分析

表1 南极磷虾基本成分

南极磷虾蛋白是优质蛋白质，氨基酸种类齐全，而且磷虾蛋白的生物价比其他肉类蛋白和奶类蛋白(例如酪蛋白)高。由表1可知，蛋白质是南极磷虾除水分外的主要成分，干基蛋白质含量高达63.34%，这与Grantham的研究结果相一致[11]。南极磷虾含有3.88%的粗脂肪，灰分和氟含量也相当高，分别为2.70%和278 mg/kg(鲜重计)，若以干重计，其氟含量高达1336 mg/kg。美国FDA规定鱼蛋白浓缩物的氟含量最高为100 mg/kg，而我国的限量标准更为严格，GB 2762-2005规定肉类和鱼类(淡水)的氟含量不得高于2 mg/kg。可见，未经处理的南极磷虾其氟含量远远超过这些安全标准，直接食用南极磷虾可能会对人体有害。

2.2 最佳外源酶的筛选

图1 不同外源酶对南极磷虾蛋白酶解效果的比较

图2 不同外源酶对南极磷虾氟溶出效果的比较

选用目前常用的食品级蛋白酶，包括最适pH在酸性(PR23、酸性蛋白酶)、中性(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶)和碱性蛋白酶来酶解南极磷虾。由图1可知，胰酶的酶解效果最好，蛋白回收率高达68.42%，水解度为29.66%；其次为PR23和碱性蛋白酶，它们的蛋白回收率分别为55.44%和55.42%。木瓜蛋白酶的酶解效果最差，蛋白回收率和水解度仅为39.97%和16.71%。由图2可知，酸性条件酶解的样品氟溶出率最大，PR23和酸性蛋白酶酶解样品的氟溶出率分别高达12.60%和12.85%。除了胰酶外，中性和碱性条件下酶解对南极磷虾的氟溶出率影响最小。Qi等[12]在碱溶酸沉法提取磷虾蛋白时发现pH值对南极磷虾氟溶出效果没有影响；而Wang认为南极磷虾中的氟具有酸溶出特性，本文的实验结果正好验证了后者的结论。胰酶样品的氟溶出率最高，这可能与蛋白质降解有关。冻藏过程中南极磷虾中的氟会逐渐迁移到磷虾肉中，磷虾肉中本来就有的氟和迁移进来的氟在酶解过程中与蛋白质结合能力变弱，大量的氟因而转移到酶解液中。综合考虑蛋白回收率和氟溶出率，我们选择胰酶来进行后续的工艺优化研究。

2.3 低氟南极磷虾酶解物的响应面优化分析

2.3.1 回归模型的建立

根据Box-Benhnken原理设计优化实验。为了反映酶解过程中的磷虾蛋白水解情况和氟溶出规律，我们选择Y1蛋白质回收率、Y2溶出率作为响应值。综合预实验中单因素实验所得的结果，固定外源酶的添加量为0.1%(E/S)，料液比为1∶1，选择对响应值影响较大的3个影响因素——酶解pH、温度、时间来进行响应面优化，以求得到蛋白回收率高、氟溶出率低的南极磷虾最优酶解工艺，实验因素水平见表2，具体实验结果见表3。

表2 响应面优化法各因素和水平设计

表3 南极磷虾酶解响应面分析方案及实验结果

使用Design Expert(Trial Version 8.0.5)来进行三因素三水平响应面优化设计，总共有15个实验点，其中12个为实验点，3个为中心点，以估算误差。利用二次回归方程对表3中15个实验点的响应值和因素进行数据拟合，得到以下数学模型：

Y1=68.18+1.79A+1.01B+2.09C+0.048AB+1.27AC+1.30BC+0.12A2-0.21B2-2.37C2；

Y2=20.41-0.19A+2.04B+0.17C-0.53AB+0.073AC+0.56BC+0.14A2-1.79B2-1.46C2。

2.3.2 回归模型的检验

表4 蛋白质回收率的响应面二次模型方差分析

表5 氟溶出率的响应面二次模型方差分析

由表4和表5可知，这两个模型的F值分别为14.47和12.87，对应的P值为0.0045和0.0058，均小于0.01，说明这两个数学模型具有高度显著性；失拟项(lack of fit)表示模型预测值与实际值不拟合的概率，表4和表5中失拟项均大于0.05，说明模型失拟不显著；模型复相关系数R2分别为96.3%，95.86%，表明有大约3.7%和4.14%的总量变异不能由模型进行解释；变异系数分别为1.33%和3.67%，说明数据离散程度小；两个模型的信噪比(Adeq Precision)均大于4。上述参数说明实验值和预测值之间具有很好的拟合度，这两个模型因素水平区间设计合理，可用于对低氟南极磷虾酶解物的制备工艺实验进行分析、预测。对于蛋白质回收率模型， A(pH)，C(时间)和C2对结果有极显著性影响；B(温度)，AC，BC有显著影响；B(温度)，B2，C2对氟溶出率有极显著影响；A(pH)，C(时间)和交互项对氟溶出率不显著。由F值和P值可知，一次项中，时间和pH对蛋白回收率影响最大，温度影响最小，但温度却是影响氟溶出率的最主要因素。由此可知，各个因素对蛋白质回收率和氟溶出率的影响不是简单的线性关系。

2.3.3 回归模型降维分析

图3 蛋白回收率和氟溶出率的响应面分析

由图3中a可知，随着温度和pH的升高，南极磷虾酶解液的蛋白回收率逐渐上升，而且pH对蛋白回收率的影响比温度更大，两者交互作用不显著，这与方差分析结果一致；在50～55 ℃，pH在7～7.5之间蛋白回收率有最大值，这可能是因为该条件接近胰酶和南极磷虾内源性蛋白酶水解系统的最适pH和最适温度。Wang等研究南极磷虾二段自溶工艺时发现南极磷虾第一段自溶和第二段自溶的最优pH分别为7.5和7.23；Kolakowski等[13]研究认为50～55 ℃是利用内源酶酶解得到南极磷虾多肽的最优温度。由此可见，在该条件下外源酶和内源酶协同酶解效果最好。

由图3中b可知，当酶解时间较短时，温度对蛋白回收率的影响不明显；酶解时间较长时，随着酶解温度升高，蛋白回收率逐渐变大；在整个酶解过程中，随着酶解时间的延长，蛋白回收率逐渐上升趋于平缓，甚至有些下降。

由图3中c可知，温度处于低水平时pH对氟溶出没有显著影响，高温条件下pH值越低，氟越容易溶出。Wang在研究中也发现酸性条件下南极磷虾中的氟更容易溶出，并利用该特性提取出低氟南极磷虾蛋白。由图3中c也可知，高温酶解时的氟溶出率明显高于低温酶解时的氟溶出率，这可能是因为温度升高导致南极磷虾中的氟活化能越来越大，氟更容易迁移到酶解液中；此外，随着蛋白回收率的提高，南极磷虾蛋白在酶解过程中逐渐降解小分子肽和游离氨基酸，导致原先与蛋白质结合的氟化物被释放出来。

由图3中d可知，低温条件下延长酶解时间，氟溶出率几乎没有变化，而高温下随着酶解时间的增加，氟溶出率逐渐增大。可见，长时间高温酶解会造成酶解物的氟含量过大，降低产品安全性。

2.3.4 模型最优分析与验证实验

利用软件对实验结果进行响应面最优化，在料液比1∶1，胰酶添加量0.1%(原料计)的条件下，将蛋白质回收率优化目标设定为“maximize”，氟溶出率优化目标设定为“minimize”，得到蛋白回收率高、氟溶出率低的南极磷虾酶解工艺：酶解时间7 h，酶解温度45 ℃，酶解pH 7.5，此时蛋白回收率和氟溶出率分别为68.52%和15.29%。我们采用上述最优工艺，得到实际条件下蛋白回收率和氟溶出率分别为69.64%和15.52%，预测值和实验值相差仅1.12%和0.23%，可见该模型预测可行。最优条件下AKPHs水解度为30.71%，氟含量较低，仅为24.90 mg/kg，远远低于美国FDA的限量标准(100 mg/kg)，但是该含量仍然远远高于中国水产品氟化物限量(2 mg/kg)，可见本文制备的南极磷虾酶解液还需要深度脱氟处理，以达到中国食用标准。

2.3.5 AKPHs肽分子量分布

采用凝胶色谱测定南极磷虾酶解液的肽分子量分布，结果见表6。

表6 酶解产物肽分子量分析结果

由表6可知，相对分子量在1000～3000 Da的组分为AKPHs的主要成分，占比为47.97%，其次为分子量小于500 Da的组分和分子量在3000～5000 Da的组分，占比分别为20.11%和14.73%。酶解液中大分子物质含量最少，分子量大于10000 Da的组分和分子量在5000～10000 Da的组分仅占AKPHs的0.54%和4.25%。由此可见，在酶解过程中南极磷虾中的大分子蛋白质逐渐被水解成小分子的多肽和氨基酸，小分子量物质(主要为多肽和游离氨基酸)是南极磷虾酶解液的主要成分。已有文献报道，小分子肽不仅容易被人体吸收利用，而且具有许多生理活性，例如抗氧化、降血压功效等。目前国内外研究的生物活性肽其分子量主要集中在3000 Da以下，本实验制得南极磷虾酶解物分子量小于3000 Da的组分高达80.48%，这也预示着AKPHs具有较高的营养价值和生理活性，值得我们对其进行深入研究。

2.3.6 AKPHs营养学特性分析

蛋白质的营养价值主要与其含有的氨基酸种类、含量和比例有关。AKPHs的氨基酸组成见表7。

表7 AKPHs氨基酸组成分析

注：Trp在强酸水解过程中被破坏；必需氨基酸包括Met，Trp，Leu，Ile，Phe，Lys，Val，Thr；支链氨基酸包括Leu，Ile，Val；抗氧化氨基酸包括His，Tyr，Met，Cys；鲜甜味氨基酸包括Glu，Asp，Phe，Tyr，Ala，Gly；疏水性氨基酸包括Ala，Val，Trp，Met，Leu，Ile，Tyr，Phe，Pro。

由表7可知，AKPHs氨基酸组成丰富，种类齐全，几乎含有构成蛋白质的所有氨基酸。其中，谷氨酸和天冬氨酸的含量最高，分别为6.76，4.43 mg/mL，而胱氨酸含量最低，仅为0.217 mg/mL。AKPHs含有所有必需氨基酸，其含量占总氨基酸的41.18%；Cys，Met，Tyr和His等抗氧化氨基酸和Leu，Ile，Val等支链氨基酸的含量也较高，其含量分别占总氨基酸的8.29%和18.99%，表明AKPHs具有较高的营养价值和生理活性。AKPHs的疏水性氨基酸的含量极高，占总氨基酸的40.37%，这些氨基酸对AKPHs的抗氧化活性有一定的贡献作用。此外，Asp，Glu，Gly和Ala等鲜甜味氨基酸的含量高达47.50%，说明AKPHs鲜甜味突出，口感好。为了进一步评价AKPHs的营养价值，我们将其与FAO/WHO/UNU(2007)推荐模式比对分析。由表7可知，除了缬氨酸的含量和氨基酸评分比推荐模式略低外，其他的氨基酸含量都满足或超过FAO/WHO/UNU(2007)推荐的成人模式[14]，说明AKPHs营养价值高，能够满足人们的营养需求。

3 结论

南极磷虾蛋白质含量高，其干基蛋白质含量为63.34%，但是其干基氟含量高达1336 mg/kg，远远高于FDA限量标准(100 mg/kg)和中国水产品安全标准(2 mg/kg)，如果直接食用未经处理的南极磷虾可能会对人体有害。

酶解温度越高，氟的溶出率越大，酸性条件也会促进南极磷虾氟溶出。在对南极磷虾进行酶解处理时可以选择最适pH在中性范围的蛋白酶类，避免在酸性条件下酶解。

通过Box-Benhnken响应面优化法得到低氟南极磷虾酶解物制备工艺，最优酶解条件为：料液比1∶1，胰酶添加量0.1%(原料计)，酶解温度45 ℃，pH 7.5，酶解时间7 h，此时蛋白质回收率和氟溶出率分别为69.64%和14.25%，酶解物的氟含量仅为24.90 mg/kg，远远低于FDA安全限量标准100 mg/kg。

AKPHs的组成成分以小分子肽为主，小于3000 Da的组分高达80.48%，其中小于500 Da的组分和1000～3000 Da的组分分别为20.11%和47.97%。AKPHs氨基酸含量丰富，必需氨基酸、支链氨基酸、抗氧化氨基酸、鲜甜味氨基酸和疏水性氨基酸占比分别为41.18%，18.99%，8.29%，47.50%和40.37%，除了缬氨酸的含量和氨基酸评分比推荐模式略低外，其他的氨基酸含量都满足FAO/WHO/UNU(2007)推荐的成人模式。

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Preparation of Antarctic Krill Hydrolysates with Low Fluoride Content and Evaluation of Their Nutritional Properties

HUANG Jun-wei1, ZHANG Shao-min2, LIU Hui-yan2, CUI Chun1*, ZHAO Mou-ming1

(1.School of Food Science and Engineering, South China University of Technology,Guangzhou 510641, China; 2.Department of Food Engineering, Guangdong Vocational College of Environmental Protection Engineering, Foshan 528216, China)

Synergistic hydrolysis of Antarctic krill (Euphausiasuperba) is performed with exogenous and endogenous enzymes, and fluoride dissolution patterns as well as proteolysis characteristics are investigated in this study. The fluoride dissolution rate and protein recovery are as response values, response surface methodology (RSM) is applied to optimize the preparation of Antarctic krill hydrolysates with low fluoride content. Their nutritional values and antioxidant activities are determined. Hydrolysis temperature of 45 ℃, initial pH of 7.5 and hydrolysis duration of 7 h are the optimal parameters. Under the above conditions, the fluoride dissolution rate and protein recovery are 15.52% and 69.64% respectively. The fluoride content of Antarctic krill protein hydrolysates is 24.90 mg/kg, which is far below the FDA limit. The hydrolysates with molecular weight <3000 Da accounting for 80.48% of Antarctic krill hydrolysates, the peptides with MW of 1000～3000 Da and hydrolysates with MW<500 Da accounting for 47.97% and 20.11% respectively. Among the total amino acids, the essential amino acids, branched-chain amino acids, antioxidant amino acids, umami and sweet amino acids and hydrophobic amino acids accounting for 41.18%, 18.99%, 8.29%, 47.50% and 40.37% respectively. All amino acids are in sufficient amount to meet FAO/WHO/UNU requirements for adults except Val.

Antarctic krill; enzymatic hydrolysis; fluoride; nutritional value

2016-11-17 *通讯作者

广州市科技计划项目(201604020067)

黄俊伟(1991-)，男，硕士，研究方向：食品生物技术；

崔春(1978-)，男，教授，博士，研究方向：食品生物技术。

TS201.4

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.006

1000-9973(2017)05-0021-07