不同黄芪用量补阳还五汤对糖尿病大鼠周围神经修复再生的影响*

河北中医学院中西医结合学院

贲 莹 张凤华 张 冬 方 倩 杜澍金(石家庄 050091)

方 药 研 究

不同黄芪用量补阳还五汤对糖尿病大鼠周围神经修复再生的影响*

河北中医学院中西医结合学院

贲 莹 张凤华 张 冬 方 倩 杜澍金(石家庄 050091)

目的：探讨不同黄芪用量补阳还五汤对糖尿病大鼠周围神经再生修复的影响。方法：用链脲佐菌素 (STZ) 诱导建立 SD 大鼠糖尿病周围神经病变(DPN)模型，并随机分为模型组、60 g黄芪组、120 g黄芪组和弥可保组。60 g黄芪组和120 g黄芪组分别用含对应量黄芪的补阳还五汤浓度煎剂灌胃，弥可保组用175 μg/kg·d-1弥可保灌胃，另设正常对照组。给药 12 周后，检测空腹血糖 ( FBG) 、坐骨神经传导速度、血液流变学变化、神经生长因子mRNA(NGF mRNA)表达水平和坐骨神经半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 (caspase-3) 活性。结果：与模型组比较，120 g黄芪组坐骨神经传导速度、NGF mRNA表达明显上升，高、中、低切全血黏度、血浆黏度及caspase-3 活性明显下降(P<0.05，P<0.01)；60g黄芪组感觉神经传导速度、NGFmRNA表达上升，低切全血黏度、血浆黏度下降 (P<0.05) 。结论：补阳还五汤能促进神经修复、再生，减少神经细胞凋亡，提高坐骨神经传导速度，对DPN有治疗作用。其中120g黄芪用量的补阳还五汤疗效更好。

糖尿病周围神经病变; 补阳还五汤; 黄芪；不同剂量；消渴；痹证；补气活血通络

糖尿病周围神经病变(DPN) 是临床糖尿病患者常见的并发症之一，经神经功能检查证明60%～90%的糖尿病患者均出现不同程度的周围神经病变，[1]其发病机制为多因素复合致病：神经营养因子缺乏、微血管病变、代谢紊乱、氧化应激损伤等。致病因素虽多，最终的结果却都是造成周围神经变性、坏死，修复、再生障碍。

传统中医理论认为消渴日久，脾失健运，气虚不能行血，使瘀血阻于络脉，气血不能灌渗濡养而发为本病。[2]笔者在临床中对DPN患者采用补阳还五汤加减治疗，取得了较好疗效。补阳还五汤见于清·王清任所著《医林改错》，该方特点是大剂量应用黄芪为君药，书中写到 “黄芪用一二两，以后渐加至四两”。并配以活血药物，起到补气活血通络的作用。

本实验拟检测不同黄芪用量补阳还五汤对糖尿病大鼠血液流变学、周围神经传导速度、周围神经凋亡及再生修复的影响，探究补阳还五汤对糖尿病周围神经病变的治疗作用及机制，明确黄芪的最佳用量，以期指导临床用药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:雄性体质量为180～220gSD大鼠50只，由河北医科大学实验动物中心提供(动物合格证号1301053)。

1.1.2 药物:补阳还五汤根据《医林改错》所载，设为2种组方：一种为黄芪60g，当归6g，赤芍、川芎各4.5g，桃仁、红花、地龙各3g；另一种为黄芪120g，其余药物用量不变。以上2种组方药物分别持续浸泡2h，水煎2次，40min/次，将2次药液混合、进一步浓缩，所得2组浓缩液各含生药1.36g/mL、2.4g/mL。弥可保由卫材(中国)药业有限公司生产。

1.1.3 试剂：链脲佐菌素(STZ)购于Sigma公司；大鼠半胱天冬酶3(Caspase-3)Elisa试剂盒购于BG公司；逆转录试剂盒购自上海生物有限公司，引物由上海生物有限公司合成。

1.1.4 仪器：肌电图诱发电位仪(DANTECCantata)；全自动血液流变仪(型号LBY-N7500B，北京普利生仪器有限公司)；OnetouchII型血糖仪(美国强生公司)，北京普利生仪器有限公司；扩增仪(ThermoPx2)；凝胶成像系统(GelLoglc100)。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模：将实验动物随机分为5组，正常对照组、模型组、60g黄芪组、120g黄芪组、弥可保组，每组10只。12h禁食后，除正常组外，其余各组大鼠给予链脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射。对照组大鼠给予等量的柠檬酸缓冲液腹腔注射。糖尿病大鼠模型确立标准：72h后大鼠禁食8h，测尾静脉血糖≥16.7mmol/L。

1.2.2 药物干预：造模成功后，60g黄芪组、120g黄芪组立即开始每天给予相应黄芪剂量浓缩药液，按10mL/kg灌胃；弥可保组立即开始每天给予弥可保175μg/kg灌胃；等体积的蒸馏水给予对照组和模型组。药物干预持续12周，干预期间给予自由饮食。

1.2.3 指标检测：除空腹血糖外，其余检测项目均在药物干预结束后进行。

1.2.3.1 周围神经传导速度检测：以水合氯醛(仅作用于中枢神经，对周围神经无影响)麻醉实验大鼠，检测右侧坐骨神经传导速度。第一刺激部位为坐骨窝，第二刺激部位为踝部。均经皮插入间距为 2mm的2个针电极。 (1)感觉神经传导速度(SCV):H反射用方形波在坐骨窝和踝部刺激激发，分别记录反射潜伏期。计算两刺激部位的潜伏期差值，并测量坐骨窝和踝部间的距离。距离/潜伏期差值即为SCV。 (2)运动神经传导速度(MCV):在同侧足部骨间肌放置2个针电极。以方形波刺激，记录M波潜伏期，求得两刺激部位的潜伏期差值。测量坐骨窝和踝部间的距离。距离/潜伏期差值即为MCV。

1.2.3.2 血液相关指标检测：分别于4、8、12周进行尾静脉采血检测空腹血糖(FBG)。药物干预结束后，腹主动脉采血，全自动血液流变仪测定血液流变学指标。

1.2.3.3 坐骨神经NGFmRNA测定：取坐骨神经并置液氮中保存，Trizol一步法提取坐骨神经总RNA。应用逆转录聚合式酶联反应技术(RT-PCR)检测NGFmRNA表达。引物序列：5'-CGGCTTTGGTGACTGGATAG-3'，5'-TGAGGACCAGAGCAGACAGG-3'，125bp。GAPDH为内参，引物序列：5'-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3'，5'-GTTTCTTACTCCTTGGAGG-3'，200bp。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后成像，用凝胶成像分析系统对各电泳条带平均光密度值分析，以NGF/GAPDH的比值半定量反映NGFmRNA在坐骨神经中的表达水平。

1.2.3.4 坐骨神经caspase-3检测：给药结束后，取双侧坐骨神经。生理盐水预冷，清洗去除坐骨神经上的杂质，残留水分用滤纸吸干，坐骨神经置于液氮中冻存，待测Caspase-3。ELISA法测定坐骨神经Caspase-3，操作依据试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 不同时间段FBG检测结果 模型组及3组药物干预组FBG均较对照组显著增高。组间比较差异无显著性。详见表1。

2.2 坐骨神经传导速度变化 模型组坐骨神经MCV和SCV较对照组显著减慢(P<0.01)；120g黄芪组和弥可保组MCV较模型组增高(P<0.05)；3药物干预组SCV较模型组提高，其中120g黄芪组提高更显著(P<0.01)。详见表1。

组别FBG(mmol/L)4周 8周 12周MCV(m/s)SCV(m/s) 对照组4.96±0.635.02±0.584.87±0.5145.26±4.3546.45±7.12模型组26.54±3.77△25.83±4.14△26.10±3.81△30.17±5.16△29.21±9.38△60g黄芪组27.21±3.2626.36±3.5225.97±2.7234.82±6.3637.06±6.74*120g黄芪组26.25±3.8925.74±3.1624.16±3.0537.36±6.22*40.17±5.25**弥可保组27.12±4.7627.03±3.8526.68±3.7236.30±7.12*38.14±6.86*

注：与对照组比较，△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.3 血液流变学变化 模型组较对照组低切、中切、高切全血黏度及血浆黏度显著升高(P﹤0.01)。与模型组比较，60g黄芪组可显著降低低切全血黏度和血浆黏度(P﹤0.05)，120g黄芪组可显著降低低切、中切、高切全血黏度及血浆黏度(P﹤0.05)。详见表2。

2.4 坐骨神经NGFmRNA表达和caspase-3 活性的变化 与对照组比较，模型组坐骨神经NGFmRNA表达明显降低，而caspase-3 活性明显升高，(P<0.01)。与模型组比较，60g黄芪组、120g黄芪组和弥可保组NGFmRNA表达均明显增高(P<0.05，P<0.01)。120g黄芪组和弥可保组caspase-3活性较模型组降低(P<0. 01，P<0.05)。详见表2。

组别全血黏度(mPa·s)低切中切高切血浆黏度(mPa·s)Caspase-3(ng/mL)NGFmRNA相对表达量对照组9.36±1.795.68±1.534.52±1.121.41±0.2618.17±2.510.94±0.03模型组14.35±4.18△8.37±1.14△7.51±1.84△2.15±0.42△31.74±4.92△0.50±0.09△60g黄芪组11.42±3.46*7.07±1.636.01±1.721.71±0.45*28.33±3.820.68±0.07*120g黄芪组10.87±4.09*6.91±1.54*5.32±1.752*1.69±0.47*25.45±3.67**0.73±0.10**弥可保组12.12±4.767.03±3.856.68±3.721.83±0.5326.04±3.73*0.74±0.09**

注：与对照组比较，△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

DPN确切发病机制尚不完全清楚, 是多因素共同作用的结果，其中血液流变学改变造成的微循环障碍及NGF水平的降低是其中的2个重要因素。血流变学改变致使神经微血管灌注减少，神经缺血、缺氧，进而发生变性坏死。NGF可由轴突逆向运输，有营养神经元，支持神经结构，保护受损神经元，促进损伤后的修复再生的作用。[3-4]DPN时，NGF减少且延轴突逆行运输能力下降，继而使周围神经修复再生能力下降。[5]有研究表明，DPN大鼠坐骨神经中NGFmRNA表达水平明显降低，其降低程度与病情轻重呈正比。[6-7]本实验中，模型组血黏稠度升高，NGFmRNA表达下降，促使神经细胞凋亡，符合相关报道。[6-7]从中医角度看，血黏稠度增高是血瘀证表现,[8]NGFmRNA表达下降可辨为正气虚。气为血之帅，气虚则血瘀，正虚邪实，发而为病。在临床中，笔者发现多数DPN患者辨证为气虚血瘀证，与上面的分析相一致。根据实验结果，补阳还五汤能提高坐骨神经传导速度(神经传导速度下降是诊断DPN的金标准)，降低血黏稠度，使NGFmRNA表达升高，降低caspase-3 活性。说明补阳还五汤能从血液流变学和NGF两个方面发挥作用，改善糖尿病大鼠的周围神经血供，促进神经修复、再生，减少神经细胞凋亡。

补阳还五汤是清·王清任所创补气活血通络方剂。该方重用黄芪，大补元气，令气旺血行，瘀去络通，其用量远远大于其他活血药物，为君药。原书中写到“黄芪用一二两，以后渐加至四两”，用量之大在其它方剂中较为少见。这样组方可使气旺血行，活血而不伤正，为气虚血瘀理论的代表性方剂。目前，以补阳还五汤化裁治疗DPN报道有50余篇，结果均表明其有确切疗效，但这些报道的黄芪用量多在30～60g之间，[9-10]本实验显示120g黄芪用量的补阳还五汤治疗效果优于60g黄芪用量的补阳还五汤。此结果进一步印证了“气虚则血瘀，气旺则血行”的中医基础理论。故应用补阳还五汤治疗DPN时，建议王清任原方120g黄芪用量，其疗效更佳。

由于DPN为多因素致病，本实验仅从血液流变学和NGF两个方面进行了探讨，补阳还五汤是否还从其它靶点发挥效用，尚需进一步深入研究。

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(2017-01-06 收稿)

*河北省教育厅科研青年基金项目：No.QN2014019

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