嗜盐古生菌混合菌株的鱼露发酵工艺优化

袁丽，孙楚楚，赵梦琴，陆文婷，崔恒林，高瑞昌

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江，212013)

嗜盐古生菌混合菌株的鱼露发酵工艺优化

袁丽，孙楚楚，赵梦琴，陆文婷，崔恒林，高瑞昌

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江，212013)

以嗜盐古生菌TBN4(Halobacteriaceaesp.)、深红盐颗粒形菌RO2-11 (Halogranumrubrum)和向烟氏盐微菌9738(Halomicrobiummukohataei)3株嗜盐古生菌为混合菌株发酵剂，以低值龙头鱼为原料，以氨基酸态氮含量、可溶性总氮含量、组胺含量、游离氨基酸总含量和有价值挥发性风味物质相对比例为指标，利用均匀设计方法对加盐量、发酵温度、发酵时间、接种量和添加3种菌的比例等参数进行优化。结果表明，利用上述3种嗜盐古生菌对龙头鱼发酵生产鱼露的最佳发酵条件为添加盐量15%、发酵温度42 ℃、发酵6个月、添加菌种量107CFU /mL、菌种比例3∶1∶1。氨基酸态氮含量、可溶性总氮含量、组胺含量、游离氨基酸总含量和有价值挥发性风味物质相对比例理论值分别为1.682 g/100 mL、3.615 g/100 mL、24.395 mg/100 mL、485.898 mg/100 mL和0.856。

嗜盐古生菌；混合菌株发酵剂；鱼露；发酵工艺优化；均匀设计

鱼露(fish sauce)，又称鱼酱油，是重要调味料之一，主要用于潮州菜、闽菜和东南亚料理中。它是在高盐环境中，以低值小鱼虾或水产品加工下脚料为原料，通过鱼体所含的酶系以及各种微生物分解原料中的脂肪、蛋白质等营养成分来发酵制成[1]，发酵周期长达1年或以上。近几年来，越来越多的学者对缩短鱼露发酵周期进行了研究[2-6]，其中采用添加微生物群加快发酵的方法越来越受到重视[5-7]。

泰国研究人员成功从鱼露发酵液中提取出具有耐盐性且蛋白酶活性高的微生物，如Halobacteriumsalinarium(嗜盐杆菌)[8-9]，并针对枯草杆菌和地衣芽孢杆菌产生的蛋白酶进行了特性研究。SINSUWANA等人从泰国鱼露中分离出杆菌Virgibacillussp. SK33(枝芽孢菌属)[10]。但是，单一的嗜盐古生菌菌株所产生的酶类难以完全分解鱼体内大分子营养物质，而多种嗜盐古生菌种混合则可以充分利用鱼体中的蛋白质、脂肪等物质，将其降解为易吸收利用的小分子肽及脂肪酸等，从而提高鱼露的营养价值，改善鱼露的风味口感[11]。

本文利用前期筛选出的嗜盐性古生菌种，利用均匀设计对嗜盐古生菌发酵龙头鱼的工艺进行了优化，确定出龙头鱼鱼露的最佳发酵工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嗜盐古生菌TBN4(Halobacteriaceaesp.)和深红盐颗粒形菌RO2-11(Halogranumrubrum)，由课题组从台南盐田筛选鉴定，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号分别为CGMCC 1.10122和CGMCC 1.7738；向烟氏盐微菌9738(Halomicrobiummukohataei)，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.6192；龙头鱼购自镇江欧尚超市。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；LRH系列生化培养箱，上海一恒科技有限公司；HP 6890/5973气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；顶空固相微萃取器SPMC-57328U，美国Agilent公司；自动氨基酸分析仪S433D/S433，德国sykam公司。

1.3 实验方法

1.3.1 混合发酵剂制备

将保藏的3株嗜盐古生菌置于液体培养基(Neutral Oligotrophic Medium, NOM)中活化，活化后接种至含液体NOM培养基的试管中，置于37 ℃恒温培养箱中扩大培养[17]，于3 d后，每天测OD600 nm值，直至菌数达到109CFU/mL水平，然后根据均匀设计表将菌株按比例和添加量混合，制成混合发酵剂。

1.3.2 鱼露的制作

将龙头鱼去除内脏，切碎，按照均匀设计表设计不同条件下的鱼露进行发酵。

1.3.3 均匀设计表

对盐含量、发酵温度、发酵时间、菌的接种量(对数)和添加3种菌的比例进行试验，氨基酸态氮含量、可溶性总氮含量、组胺含量、游离氨基酸总含量和有价值挥发性风味物质相对比例等为指标，得出鱼露发酵的最佳条件。各因素的水平范围如表1所列，采用拟水平方法，随机抽取，均匀设计表如表2所示。

表1 均匀设计因素水平表

注：*混合菌株比例为TBN4∶9738∶RO2-11

表2 均匀设计表

注：*混合菌株比例TBN4∶9738∶RO2-11。

1.3.4 数据处理

为了解各因素的影响作用，采用均匀设计方案，以各指标含量为目标，利用SPSS软件和二项式逐步回归法，对均匀试验结果进行回归分析，并对结果相互进行比较，选取合适的回归结果，得出最佳发酵工艺。

2 结果与分析

2.1 氨基酸态氮

2.1.1 均匀试验结果

根据表3分析，氨基酸态氮含量在试验13条件下含量最高，即盐含量10%，发酵温度30 ℃，发酵时间5个月，菌种添加量109CFU/mL，菌种间比例2∶2∶1，氨基酸态氮含量为0.750 g/100 mL。

表3 氨基酸态氮均匀设计试验结果

2.1.2 试验结果的回归分析

选取氨基酸态氮含量Y1，含盐量X1，发酵温度X2，发酵时间X3，添加菌种量X4，菌种间的比例X5，利用SPSS二项式逐步回归。拟合决定系数R2为0.950，拟合度良好。鱼露发酵所得氨基酸态氮含量(g/100mL)的回归方程为：

Y1=1.798-0.088X1+0.441X3-0.206X4+0.351X5

对方程进行显著性分析检验，分析结果如表4，F值为57.466，P值为0.000，认为回归模型显著。

表4 方程显著性检验

注：a为预测变量。

根据回归结果，以氨基酸态氮含量为目标，得到的最优鱼露发酵条件为添加盐量10%、发酵温度30～46 ℃(30、34、38、42、46 ℃)、发酵时间6个月、添加菌种量107CFU/mL、菌种间的比例3∶1∶1，得到最高的氨基酸态氮含量2.122 g/100 mL，高于直观分析结果。一般来说，蛋白酶酶活性受盐含量的影响较大，盐浓度过高易使得酶失活。可能是因为高浓度盐环境造成的高渗透压作用，降低了菌产生的蛋白酶以及鱼体中的蛋白酶结构的稳定性，使蛋白酶酶活下降甚至蛋白酶发生变性，进而对蛋白质的水解效果产生了不良影响；另外，高盐度也可能使分解出的蛋白质部分发生盐析，导致发酵液中的蛋白质含量相对减少，最终导致氨基酸态氮下降[12]，所以低盐度更加有利于氨基酸态氮的累积。在一定为范围内，添加菌种量越多，产生的蛋白酶更多，发酵速度也随之加快，但添加菌种量与分解蛋白质并不成正比例关系[14]。最佳添加菌种量为107CFU/mL，可能是因为嗜盐古生菌株具有转氨和脱氨作用，嗜盐古生菌株含量越高，氨基酸的代谢能力越强，不利于氨基酸态氮的累积，因此高含量菌株对氨基酸态氮含量的增长会产生负影响。

2.2 可溶性总氮

2.2.1 均匀试验结果

可溶性总氮均匀设计试验结果如表5所示。

表5 可溶性总氮均匀设计试验结果

据表5可知，可溶性总氮含量在试验5条件下含量最高，即盐含量15%，发酵温度34 ℃，发酵时间4个月，菌种添加量108.5CFU/mL，菌种间比例1∶1∶1～3∶1∶1(均分为5水平：1∶1∶1、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1、3∶1∶1)，可溶性总氮含量为1.151 g/100 mL。

2.2.2 试验结果的回归分析

选取可溶性总氮含量Y2，含盐量X1，发酵温度X2，发酵时间X3，添加菌种量X4，菌种间的比例X5，利用SPSS二项式逐步回归。拟合的决定系数R2为0.980，故拟合度良好。鱼露发酵所得可溶性总氮含量(g/100mL)的回归方程为：

Y2=-0.065X1+0.545X3+0.460X4-1.900

对方程进行显著性分析检验，回归分析结果如表3.7，F值为10.112，P值为0.000，认为回归模型十分显著。

表6 方程显著性检验

注：a为预测变量。

根据回归结果，以可溶性总氮为目标，得到最佳的鱼露发酵条件为添加盐量10%、发酵温度30～46 ℃(30、34、38、42、46 ℃)、发酵时间6个月、添加菌种量109CFU/mL、菌种间的比例1∶1∶1～3∶1∶1(均分为5水平：1∶1∶1、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1、3∶1∶1)，得到最高的可溶性总氮含量为4.860 g/100 mL，高于直观分析结果。类似氨基酸态氮，可溶性总氮来源于蛋白酶分解蛋白质，而鱼体自身的酶及菌产生的蛋白酶酶活性受盐浓度影响较大，盐浓度过高易使得酶失活，故低盐度更有利于可溶性总氮的产生。嗜盐古生菌含量越高，发酵时间越长，蛋白质分解程度相应随之加深，产生的氨基酸及小分子肽等物质含量也增多，越有利于可溶性总氮的累积。

2.3 组胺含量

2.3.1 均匀试验结果

据表7可知，组胺含量在试验4条件下含量最低，即盐含量30%，发酵温度38 ℃，发酵时间6个月，菌种添加量109CFU/mL，菌种间比例1∶1∶1～3∶1∶1(均分为5水平：1∶1∶1、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1、3∶1∶1)，组胺含量为1.135 mg/100 g。

表7 组胺均匀设计试验结果

2.3.2 试验结果的回归分析

选取组胺含量Y3，含盐量X1，发酵温度X2，发酵时间X3，添加菌种量X4，菌种间的比例X5，利用SPSS二项式逐步回归。拟合决定系数R2为0.915，拟合度良好。鱼露发酵所得组胺含量(mg/100 mL)的回归方程为：

Y3=4.752X1+2.441X2-12.176X3+76.248X4-2.726X3X4-2.650X42-335.745

对方程进行显著性分析检验，回归分析结果如表8，F值为3.253，P值0.002，认为回归模型十分显著。

表8 方程显著性检验

注：a为预测变量。

根据回归结果，以组胺含量为目标，得到最佳的鱼露发酵条件为添加盐量10%、发酵温度30 ℃、发酵时间6个月、添加菌种量107CFU/mL、菌种间的比例1∶1∶1～3∶1∶1(均分为5水平：1∶1∶1、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1、3∶1∶1)，得到最低的组胺含量为1.069 mg/100 g，略低于直观分析结果。鱼露中的组胺含量取决于鱼发酵过程中组胺的生成，也取决于原料鱼的鲜度程度。组胺分解酶活性与盐含量有关[15]，高盐度会降低组胺分解活力，低盐度则有利于组胺的分解。在鱼露发酵过程中，组胺含量会先上升，达到一定阶段后，逐渐下降。发酵初期，组胺含量上升主要是因为盐在鱼体内分布不均，导致鱼体盐量较少部分发生轻微腐败及在细菌组氨酸脱羧酶的作用下，鱼体游离组氨酸逐渐被分解成组胺，且发酵初期更适宜组胺产生菌的生长。而随着发酵时间的延长，盐分慢慢渗入鱼体，渐渐升高的盐浓度和鱼露pH的下降，抑制组胺产生菌的生长，从而使得组胺含量下降[16]。同时嗜盐古生菌TBN4具有较强的组胺分解能力，对组胺的下降也有较大的贡献[7]。

2.4 游离氨基酸总含量

2.4.1 均匀试验结果

据表9可知，游离氨基酸含量在试验8条件下含量最高，即盐含量20%，发酵温度34 ℃，发酵时间5个月，菌种添加量108CFU/mL，菌种间比例1∶1∶1～3∶1∶1(均分为5水平：1∶1∶1、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1、3∶1∶1)，游离氨基酸总含量为521.615 mg/100 mL。

表9 游离氨基酸总量均匀设计试验结果

2.4.2 试验结果的回归分析

选取游离氨基酸含量Y4，含盐量X1，发酵温度X2，发酵时间X3，添加菌种量X4，菌种间的比例X5，利用SPSS二项式逐步回归。拟合的决定系数R2为0.887，拟合度相对较好。鱼露发酵所得游离氨基酸含量(mg/100 mL)的回归方程为：

Y4=561.271-1.745(X1-19.892)2-0.332(X2-46.926)2-24.962(X3-4.868)2-20.978(X4-8.265)2

对方程进行显著性分析检验，回归分析结果如表10，F值为5.233，P值0.035，认为回归模型显著。

表10 方程显著性检验

注：a为预测变量。

根据回归结果，以游离氨基酸含量为目标，得到最优的鱼露发酵条件为添加盐量20%、发酵温度46 ℃、发酵时间5个月、添加菌种量108CFU/mL、菌种间的比例1∶1∶1～3∶1∶1(均分为5水平：1∶1∶1、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1、3∶1∶1)，得到最高的游离氨基酸含量为559.058 mg/100 mL，略高于直观分析结果。一般来说，菌产生的蛋白酶酶活性受盐浓度影响较大，盐浓度过高易使得酶失活，同时若盐度过低，则影响嗜盐古生菌的生长及产生蛋白酶的能力，不利于将鱼体蛋白质的分解成氨基酸。一定范围内，发酵温度越高，蛋白酶的活性越强，越有利于鱼体蛋白酶的分解。最佳发酵温度为46 ℃，可能是因为46 ℃更适宜嗜盐古生菌产生蛋白酶，将蛋白质降解各种氨基酸，同时促进氨基酸之间的反应生成各种功能性肽类物质。随着发酵时间的延长，鱼露发酵更加成熟，蛋白酶对鱼体蛋白质的分解也随之加深，氨基酸含量也逐步提高。但发酵时间不宜太长，否则易产生呈苦味的氨基酸成分。最佳添加菌种量108CFU/mL，可能是因为嗜盐古生菌株具有转氨和脱氨作用，嗜盐古生菌株含量过高，氨基酸的代谢能力强，不利于氨基酸含量的增加，因此过高含量菌株对氨基酸含量的增长产生负影响。

2.5 挥发性风味物质

2.5.1 均匀试验结果

挥发性风味物质的质量评价以有价值的挥发性风味物质与总体挥发性风味物质的相对比例为指标。相对比例均匀设计试验结果如表11所示。

表11 相对比例均匀设计试验结果

据表11可知，相对比例在试验5条件下含量最高，即盐含量15%，发酵温度34 ℃，发酵时间4个月，菌种添加量108.5CFU/mL，菌种间比例1∶1∶1～3∶1∶1(均分为5水平：1∶1∶1、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1、3∶1∶1)，相对比例为0.952。

2.5.2 试验结果的回归分析

选取相对比例为Y5，含盐量X1，发酵温度X2，发酵时间X3，添加菌种量X4，菌种间的比例X5，利用SPSS二项式逐步回归。拟合的决定系数R2为0.907，拟合度良好。鱼露发酵所得挥发性风味物质的回归方程为：

Y5=-0.154X1+0.052X2-0.076(X3-2.257)2+0.1(X4-9.315)2+0.641

对方程进行显著性分析检验，回归分析结果如表3.13，F值为1.225，P值为0.027，故回归模型十分显著。

表12 方程显著性检验

注：a为预测变量。

据回归结果，以相对比例为目标，得到最佳的鱼露发酵条件为添加盐量10%、发酵温度46 ℃、发酵时间2个月、添加菌种量107CFU/mL、菌种间的比例1∶1∶1～3∶1∶1(均分为5水平：1∶1∶1、2∶1∶1、2∶1∶2、2∶2∶1、3∶1∶1)，得到最高的相对比例为0.964，略高于直观分析结果。一般情况下，高盐环境会大大降低蛋白酶活力，从而降低鱼露的发酵能力，从而影响鱼露的风味。发酵温度高可增加醛类等香味物质，改善口味并使鱼露香气变得柔和，同时有利于蛋白质分解成含氮化合物，其中包括鱼露挥发性风味物质重要的组成部分的吡啶及吡嗪类物质[14]。发酵初期，添加的盐尚未充分分布均匀，嗜盐古生菌及鱼体自身的细菌相互作用与鱼体，产生的挥发性风味物质多而杂。在发酵后期，嗜盐古生菌处于优势地位，挥发性风味物质慢慢变少，但气味变得更加醇厚。就有贡献价值的挥发性风味物质相对比例而言，发酵初期有价值的挥发性风味物质相对比例更高。最佳添加菌种量107CFU/mL，含量较低，发酵初期嗜盐古生菌与鱼体自身的细菌相互作用明显，有利于挥发性风味物质种类的增多，有利于有价值的挥发性风味物质相对比例的提高。

2.6 优化条件的确定

由鱼露发酵条件均匀试验针对不同的指标得出不同的最佳发酵条件，由于最佳条件不能一致，故在不同的最佳条件范围内，将本实验各因素设定的每一个水平分别代入以上各优化公式进行计算，参照鱼露的国家标准，通过综合比较得出鱼露最佳发酵条件。最终所得出鱼露发酵条件为添加盐量15%、发酵温度42 ℃、发酵时间6个月、添加菌种量107CFU/mL、菌种间的比例3∶1∶1。

2.7 验证性试验

在优化条件下对鱼露进行了发酵实验，所得产品的氨基酸态氮含量、可溶性总氮含量、组胺含量、游离氨基酸总含量和有价值挥发性风味物质相对比例分别为1.682 g/100 mL、3.615 g/100 mL、24.395 mg/100 mL、485.898 mg/100 mL和0.856。国家关于鱼露的标准氨基酸态氮含量高于0.90 g/100 mL及可溶性总氮含量高于1.20 g/100 mL为一级鱼露，因此优化条件下所得鱼露品质已到达了国家一级标准。

3 结论

以嗜盐古生菌TBN4(Halobacteriaceaesp.)、深红盐颗粒形菌RO2-11-(Halogranumrubrum)和向烟氏盐微菌9738(Halomicrobiummukohataei)等3株嗜盐古生菌为混合菌株发酵剂可以用来发酵低值龙头鱼生产鱼露制品，所得鱼露制品具有很高的品质。

[1] 朱志伟,曾庆孝,阮征,等.鱼露及加工技术研究进展[J].食品与发酵工业,2006,32(5): 96-100.

[2] 朱莉霞,宁喜斌.鱼露的生产技术及风味物质[J].广州食品工业科技,2004,20(3):136-138.

[3] 孙美琴.鱼露的风味及快速发酵工艺研究[J].现代食品科技,2006,22(4):280-283.

[4] 毋瑾超,碧英,胡锡钢,等.鱼肉液体制曲的工艺研究[J].湛江海洋大学学报,2002,22(3):33-37.

[5] 周秀琴.日本调味品信息[J].上海调味品,1997,2(4):27-30.

[6] 晁岱秀.分段式快速发酵鱼露工艺的研究[D].广州:华南理工大学,2010.

[7] 黄紫燕.外加微生物改善发酵鱼露品质的研究[D].广州:华南理工大学,2011.

[8] THONGTHAI C,MCGENITY T J,SUNTINANALERT P,et al.Isolation and characterization of an extremely halophilic archaeobacterization from traditionally fermented Thai fish sauce (nampla)[J].Letters in Applied Microbiology,1992,14(3):111-114.

[9] CHAIYANAN S,CHAIYANAN S,MAUGEL T,et al.Polyphasic taxonomy of a novelHalobacillus,Halobacillusthailandensissp. nov. isolated from fish sauce[J].Systematic and Applied Microbiology,1999,22(3):360-365.

[10] SINSUWAN S,RODTONG S,YONGSAWATDIGUL J.Production and characterization of NaCl-activated proteinases fromVirgibacillussp. SK33 isolated from fish sauce fermentation[J]. Process Biochemistry,2008,43(2):185-192.

[11] 李明阳.复合菌种发酵海鲜鱼露工艺条件探讨究[D].西安:西北大学,2012.

[12] 杨鑫.江苏两盐田可培养嗜盐古生菌多样性及速酿鱼露的研究[D].镇江:江苏大学,2012.

[13] 高瑞昌,陆文婷,刘向东,等.4种嗜盐古生菌发酵的龙头鱼鱼露特性比较[J].食品与发酵工业,2014,40(11):52-58.

[14] 朱莉霞,宁喜斌.盐度和加曲量对罗非鱼片加工废弃物速酿鱼露的影响[J].食品与生物技术学报,2005,24(5):47-54.

[15] 晁岱秀.分段式快速发酵鱼露工艺的研究[D].广州:华南理工大学,2010.

[16] 孙国勇,曾庆孝,江津津.鱼露前期发酵过程中组胺变化规律研究[J].中国调味品,2008,33(6):64-67.

Optimization of mixedHalophilicarchaeafermentation for fish sauce

YUAN Li, SUN Chu-chu, ZHAO Meng-qin,LU Wen-ting,CUI Heng-lin, GAO Rui-chang*

(School of Food and Biological Engneering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013, China)

Bombay duck without internal organs was used to ferment fish sauce usingHalobacteriaceaesp.,HalogranumrubrumandHalomicrobiummukohataeias mixed starter culture. Amino acid nitrogen, total soluble nitrogen, histamine, free amino acids and the relative proportion of value volatile flavor compounds were used as parameters to assess the quality of the fish sauce. Factors affecting the fish sauce fermentation such as the amount of salt, fermentation temperature, fermentation time, inoculation of bacteria and 3 kinds of bacteria proportion were optimized by uniform design. The results showed that the optimum fermentation conditions for fish sauce was 15% salt content, fermentation temperature 42 ℃, fermentation time 6 months, the amount of bacteria 107CFU/mL and the proportion of inter strain 3∶1∶1. The theoretical content of total soluble nitrogen, histamine, amino acid nitrogen, free amino acids and the relative proportion of valuable volatile flavor compounds was 3.615 g/100 mL, 24.395 mg/100 mL, 1.682 g/100 mL, 485.898 mg/100 mL, and 0.856, respectively.

Halophilicarchaea; mixed cultures; fish sauce; fermentation process optimization; uniform design

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703019

在读博士，副教授(高瑞昌教授为通讯作者,E-mail：xiyuan2008@ujs.edu.cn)。

国家自然科学基金(31340065)；江苏大学“青年骨干教师培养工程”

2016-08-17，改回日期：2016-11-07