不同鸡种DMA基因序列比较分析

孔令琳，郑圣晗，陈 颖，朱鹏飞，吴 允，郭其新，陈国宏，常国斌

(扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州225009)

不同鸡种DMA基因序列比较分析

孔令琳，郑圣晗，陈 颖，朱鹏飞，吴 允，郭其新，陈国宏，常国斌*

(扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州225009)

DMA(major histocompatibility complex， class Ⅱ， DM alpha)基因是鸡MHC Ⅱ类典型基因座，与免疫反应和抗病性密切相关。试验对25个不同鸡种的DMA基因序列进行目标捕获测序，以NCBI上Gallusgallus的DMA基因序列作为参考序列，通过MEGA6软件进行序列比对分析，筛选出不同鸡种DMA基因序列上的SNPs和Indels(insertion-deletion)位点以及氨基酸的变化，并根据基因序列的差异构建系统进化树，探究不同鸡种间的同源性。结果表明，DMA基因呈现出丰富的多态性，突变和缺失位点集中于外显子上，且多个鸡种在第2外显子发生多位碱基缺失，导致其氨基酸序列发生极大改变，可能是不同鸡种产生抗性差异的主要因素；同时进化树也显示，斗鸡、藏鸡等抗性较好的鸡种间有相近的亲缘关系，同源性较高。以上结果表明，DMA基因有丰富的遗传多样性，且与不同鸡种的先天免疫与抗病特性差异相关，第2外显子中94 496～94 552的Indels可以作为鸡免疫特性的候选标记。

鸡；DMA基因；MHC；SNPs；Indels；进化树

DMA(major histocompatibility complex， class Ⅱ， DM alpha)基因是鸡主要组织相容性复合体(MHC)基因家族一个Ⅱ类典型基因座。禽类MHC又被称为B复合物，位于16号染色体，其结构较哺乳动物的MHC更加紧凑短小，核心区域BF/BL区包含19个基因，DMA即为其中一个典型基因座，位于ClassⅡ区[1]，与DMB1、DMB2基因合称DM基因，都与抗原加工与呈递有关，它们共同编码DM分子，DMA与DMB分别编码DM分子的α链和β链，研究发现，DM分子为非经典分子，不像其他经典ClassⅡ区分子一样表达于细胞表面，而是作为Ⅱ类分子的分子伴侣在MHC Ⅱ类分子的抗原呈递过程中起决定性作用，作用为移除恒定链并使外源性抗原结合到抗原槽中。由于DM分子所处位置及其特殊功能，与DM分子相关联的疾病几乎都与自身免疫有关，这表明DMA基因在免疫性疾病的发病过程中发挥了一定的作用[2-3]。目前针对DMA基因的研究大多集中于人类或小鼠等哺乳动物上，家禽这方面的研究相对较少，而鸡作为人类的主要肉类来源之一，针对其抗性及抗病育种的研究都有重要意义。因此，本研究利用目标捕获测序法对25个不同鸡种DMA基因序列进行测序，探究抗性不同的鸡种中DMA基因发生的SNPs、Indels并对其进行系统分类比对分析，以探明该基因的遗传多样性，为家禽免疫遗传学和抗病育种提供参考依据。

1 材料与方法

本研究共选取25个鸡品种，其中白耳鸡(BE)、茶花鸡(CH)、大骨鸡(DG)、斗鸡(DJ)、固始鸡(GS)、狼山鸡(HL)、鹿苑鸡(Lu)、泰和乌骨鸡(WG)、仙居鸡(XJ)、萧山鸡(XS)、北京油鸡(YJ)、藏鸡(ZJ)等12个地方鸡种来自于中国农业科学研究院家禽科学研究所，红色原鸡(HY)采自云南省野生动物救护中心，安卡鸡(AK)、广西黄鸡(GX)、 SPF-来航鸡(SPF-LH)、东乡绿壳蛋鸡(LK)、罗斯鸡(LS)、溧阳鸡(LY)、青脚麻鸡(QJ)、如皋黄鸡(RG)、太湖鸡(TH)、文昌鸡(WC)、雪山鸡(XC)、隐性白羽鸡(YB)等12个鸡种来自扬州大学动物科学与技术学院遗传资源实验室禽种资源基因库。每个鸡种随机选取10羽鸡，翅下静脉采血2 mL，用苯酚-氯仿法提取DNA，DNA样品浓度要求大于50 ng·μL-1，4 ℃冷藏保存。将DNA样品送深圳华大基因公司(BGI)进行目标序列捕获测序。

鸡的MHC基因位于16号染色体上，针对此区域，进行目标区域捕获测序，鸡的MHC基因长约98 kb。针对此区域捕获是利用SureSelectTargetEnrichment Kit定制试剂盒并按照Aglient(中国)公司的说明书通过基因组DNA与设计的RNA探针杂交完成的。将捕获的基因组DNA运用IlluminaHiSeq 2000测序仪进行PE 100双末端测序，测序的流程为：首先对样本进行浓度及完整性的检测；质检合格后进行文库的构建，运用超声破碎的技术将基因组打碎，回收长度约为500 bp的DNA片段，两端进行修复以及加接头，桥式PCR完成文库的构建；库检合格后上机测序即可。

针对目标捕获测序结果的初始数据，首先去除reads中的接头污染，然后将reads中超过50%的低质量碱基去除(quality value ≤ 5 (E))，确保分析数据的高质量性。以NCBI上Gallusgallus(GG)的DMA基因碱基序列为参考序列，利用MEGA6软件对25个鸡种的核苷酸序列与参考序列进行比对，分析核苷酸突变位点和插入缺失位点以及氨基酸变化位点，最后运用邻接法(neighbour joining)构建进化树(phylogenetic tree)。

2 结果与分析

2.1DMA基因序列分析

本研究以NCBI上Gallusgallus的DMA基因(Gene ID: 417050)碱基序列为参考序列。由图1可知，Gallusgallus的DMA基因位点为93 874～96 249，共2 210 bp，其中外显子4个，内含子3个。

2.2 不同鸡种中DMA基因SNPs位点及Indels位点统计

目标捕获测序结果中目标区域测序深度达6×以上，覆盖度达89.2%。使用MEGA6软件比对26段DMA基因序列(包括参考序列)后发现，DMA基因在25个鸡种中共有52个SNPs和Indels位点，基本位于Exon2、Exon3、Exon4上，多数集中于Exon2，仅5个SNPs和Indels位点位于内含子，可见DMA基因有较好的多态性(表1)。

2.3 DMA基因外显子SNPs位点分布

由表2可知，25个鸡种中，仅罗斯鸡没有SNPs位点，黑狼山鸡、茶花鸡、东乡绿壳蛋鸡等鸡种存在较少SNPs位点，而斗鸡、固始鸡、SPF-来航鸡等鸡种的SNPs位点较多，大部分突变位点为有义突变，这表明DMA基因的SNPs位点与鸡种的抗病力密切相关，抗性较好的鸡种SNPs普遍多于抗性差的鸡种。

图1 NCBI中红色原鸡DMA基因序列Fig.1 DMA gene sequences of Gallus gallus in NCBI

表1 不同鸡种中DMA基因外显子和内含子核酸变化

Table 1 Nucleotide variations in exons and introns ofDMAgene

位置Sites范围Range长度Length/bpSNPs及Indels个数NumbersofSNPsandIndels比例Percentage/%外显子1Exon193874—9400012700外显子2Exon294450—947162673412.73外显子3Exon395639—9592028241.42外显子4Exon496011—9624923993.77内含子1Intron194001—9444944910内含子2Intron294717—9563892240.53内含子3Intron395921—960109000

表2 不同鸡种中DMA基因在外显子上的突变分布表

Table 2 SNPs distribution ofDMAgene in different breeds

鸡种Breeds外显子2Exon2位点SitesSNPs外显子3Exon3位点SitesSNPs外显子4Exon4位点SitesSNPsAK94669C/T95903C/A96059A/GBE94526;94669A/G;C/T95667;95903T/C;C/A96046;96085;96104G/A;C/T;C/TYJ94669C/T95646;95667;95903C/G;T/C;C/A96106C/ACH95646C/GDG96046;96106;96137G/A;C/A;C/TDJ94540;94554;94559;94565;94669G/A;A/G;G/A;A/G;C/T95646;95667C/G;T/C96046G/AGX94565;94669A/G;C/T95667;95903T/C;C/A96137C/TGS94540;94554;94559;94565G/A;A/G;G/A;A/G95667;95903T/C;C/A96106C/AHY95889T/C96046G/ALK95646C/G96108C/TSPF-LH94540;94554;94559;94565;94669;94710G/A;A/G;G/A;A/G;C/T;A/G95667;95903T/C;C/A96046G/AHL95646C/GLu95646;95903C/G;C/ALY94669C/T95646;95667;95903C/G;T/C;C/A96109G/CQJ94595;94669G/C;C/T95646;95903C/G;C/A96137C/TRG94669C/T95646;95903C/G;C/A96046G/ALSTH94669C/T95667;95903T/C;C/A96046G/AWC95667;95903T/C;C/A96046;96062;96085;96104G/A;T/C;C/T;C/TWG94669C/T95646;95889;95903C/G;T/C;C/A96106C/AXC95667;95903T/C;C/A96046G/AXJ95646C/GXS95646;95667;95903C/G;T/C;C/AYB95646C/G96137C/TZJ94669C/T95903C/A96059A/G

“/”前的为突变前的碱基，“/”后的为突变后的碱基。

The base before and after symbol “/” represents the base before and after mutation.

经比对，25个不同鸡种中Indels位点均存在于Exon2，由表3可见，共有15个鸡种在94 497～94 511位点发生基因缺失，其中SPF-来航鸡和固始鸡在94 552～94 565位点也发生了缺失，而20个鸡种在624位点都插入了一个碱基G，这些都导致DMA基因Exon2翻译产物发生巨大的变化，显示出极高的多态性。

2.4 不同鸡种DMA基因进化树分析

将26个不同鸡种(包括参考序列)DMA基因的完整序列整合为FASTA格式，利用MEGA6对25个鸡品种的DMA基因序列与参考序列进行对比分析，分析其同源性，如图2，选用Construct/Test Neighbor-Joining Tree(NJ)法构建进化树，Bootstrap的值设置成500。Bootstrap consensus tree如图3。

由图3可知26个鸡种主要分为3大类，东乡绿壳蛋鸡、茶花鸡、狼山鸡、隐性白羽鸡、罗斯鸡等鸡种类聚在一起；泰和乌骨鸡单独为一类；斗鸡、广西黄鸡、藏鸡等抗性较好的中国地方鸡种类聚在一起。上述结果表明，DMA基因在进化过程中存在丰富的遗传多样性，可能对不同鸡种的抗性产生了影响。

3 讨论

MHC基因家族作为基因组中多态性最高的基因之一，其多态性与物种抵抗多种疾病的能力存在着密切的关系。DM基因的发现是由Cho等[4]通过对小鼠MHC(H2)黏粒的筛选得到3个新的Ⅱ类相关序列而来，这3个序列后被命名为H2-MA、MB1、MB2。随后Kelly用探针5.22D和5.22C获得了人HLA的cDNA克隆RING6和RING7，分别命名为HLA-DMA和DMB，目前在许多高等动物中都发现了该基因的同源基因[5]。DMA基因所编码的DM分子，在抗原加工呈递过程中，作为经典的MHC Ⅱ类分子的分子伴侣发挥重要作用。

表3 不同鸡种DMA基因第二外显子Indels分布表

Table 3 Indels distribution in exon2 ofDMAgene in different breeds

碱基起始位点InitiationsitesIndels碱基Bases鸡种Breeds94496I1GLS、DJ、GS、ZJ、WG、XC、HY、XS、YB、CH、AK、YJ、DG、WC、TH、LY、LK、GX、XJ、BE94497D14ACATCAGTGGGGACZJ、AK、QJ、DG、DJ、WC、YB、XS、CH、LU、RG、YJ、BE、SPF-LH、GS94552D14ACACATCGGTGGGASPF-LH、GS

D和I分别表碱基缺失和插入，后面带的数字表示碱基数，即I1表示有1个碱基插入。

D and I represents base deletion and insertion， the followed number represents the base number， for example， I1 represents there was one base insertion.

图2 二十五个鸡种间亲缘关系分析Fig.2 Genetic relationship analysis of 25 chicken breeds

图3 不同鸡种NJ系统进化树Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of different breeds

本研究结果表明，DMA基因的4个外显子中，Exon2、Exon3、Exon4上均存在碱基的突变和缺失，Exon1高度保守，多态性主要集中于Exon2，尤其Exon2上多个鸡种发生基因缺失导致氨基酸序列发生巨大变化，显示出DMA基因极高的多态性，且与不同鸡种的抗病力和环境适应力直接相关，这与MHC Ⅱ类D区中经典基因的多态主要集中在外显子2的结论相符。而关于猪的DMA基因相关研究却并未得出相同结论，这可能与物种差异有关[6]。其中罗斯鸡没有发生位点突变，仅发生一个位点插入，隐性白羽鸡也基本没有SNPs位点，这可能与它们是国外鸡种，且生长速度快、性成熟早，抗性差有关。黑狼山鸡等中国地方鸡种DMA基因序列上的突变位点也相对较少，可能与保种群体相对较小有关。斗鸡、藏鸡、固始鸡这类抗病力好、抗逆性强的中国地方鸡种序列上SNPs位点相对较多。25个鸡种中有80%在第2外显子的94 496位点有碱基插入，藏鸡、安卡鸡、青脚麻鸡、大骨鸡、斗鸡、文昌鸡、隐性白羽鸡、萧山鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、如皋黄鸡、北京油鸡、白耳鸡、SPF-来航鸡、固始鸡均在94 497发生了14位Indels，其中固始鸡和SPF-来航鸡在94 552位点又发生14位Indels，这些可能都与DMA基因所编码的DM分子在免疫应答中所处位置与作用有关，可将第2外显子中94 496～94 552的Indels可以作为鸡免疫特性的候选标记。其余外显子及内含子的多态位点则十分有限，这可能与DMA基因并非Ⅱ类经典基因，进化上更为保守有关。系统进化树将斗鸡、藏鸡、固始鸡这一类抗性好、适应性强的鸡种与罗斯鸡等外来鸡种明显分开，这进一步表明了DMA基因多样性能真实反映不同鸡种的起源与遗传背景。隐性白羽鸡、罗斯鸡等外来鸡种与我国地方鸡种并没有形成单独分类，这可能与这些国外鸡种是由我国部分鸡种如黑狼山鸡杂交育成有关，在进化树上的位置也离黑狼山鸡比较近。文昌鸡、大骨鸡在进化树上与其余鸡种的位置都相对较远，这可能与它们的原产地位置偏僻有一定的联系。泰和乌骨鸡单独分为一类可能与其独特的血型有关[7]，其余中国地方鸡种分布无明显规律。

Nikolich-zugich等[8]发现，鸡MHC基因多态性和多种传染性疾病的遗传抗性高度相关。目前针对鸡的DMA基因的研究报道还相对较少，哺乳动物这方面的研究比较透彻。事实上鸡MHC上所有基因在哺乳动物MHC上都有对应基因，鸡DMA基因与哺乳动物DMA基因属于直系同源基因。国际HLA因子命名委员会已认定的DMA和DMB基因的有限等位基因与Ⅰ型糖尿病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等疾病均存在显著的相关性，且在不同人种中分布频率存在一定的差异。许多研究发现DM可能与机体保护性的免疫反应和自身免疫均有关联。Toussirot等[9]研究发现，DMA基因是风湿性关节炎发病的正性相关基因，且与发病相关部位内皮下淋巴结有关。桑艳梅等[10]发现，DM基因与Ⅰ型糖尿病的相关性之间存在一定的剂量效应规律。Morel等[11]发现，HLA-DM基因多态性对SLE的发生有一定的影响。磨美兰等[12]通过对SLA-DM等Ⅱ类分子表达研究，表明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染早期对猪肺泡巨噬细胞的外源性抗原加工和递呈功能产生显著影响，导致其外源性抗原递呈功能下降，进而影响机体的体液免疫应答。关于鸡DMA基因与疾病间相关性的研究尚不多见，仍有很大的空间。

[1] SHINA T， HOSOMICHI K， HANZAWA K. Comparative genomics of the poultry major histocompatibility complex[J].AnimalScienceJournal， 2006，77(2): 151-162.

[2] DESHAIES F， BRUNET A， DIALLO D A， et al. A point mutation in the groove of HLA-DO allows egress from the endoplasmic reticulum independent of HLA-DM[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica， 2005， 102: 6443-6448.

[3] BELLEMARE-PELLETIER A， TREMBLAY J， BEAULIEU S， et al. HLA-DO transduced in human monocyte-derived dendritic cells modulates MHC class Ⅱ antigen processing[J].JournalofLeukocyteBiology， 2005， 78(1): 95-105.

[4] CHO S G， ATTAYA M， MONACO J J. New class Ⅱ-like genes in the murine MHC [J].Nature， 1991， 353(6344): 573-576.

[5] KELLY A P， MONACO J J， CHO S G， et al. A new human HLA class Ⅱ-related locus， DMI [J].Nature， 1991， 353(6344): 571-573.

[6] 于辉，李波，李华，等. 中国小型猪SLA-DMA基因的SSCP分析[J]. 畜牧兽医学报， 2008， 39(10): 1300-1305. YU H， LI B， LI H， et al. SSCP analysis of SLA-DMA gene in Chinese miniature pigs[J].ActaVeterinariaetZootechnica

Sinica， 2008， 39(10): 1300-1305. (in Chinese with English abstract)

[7] 王洪志. 不同鸡MHC单倍型的判定及同种异型抗血清的制备[D]. 扬州: 扬州大学， 2015. WANG H Z. Determination of MHC haplotypes and preparation of alloantiserum in different chicken breeds[D]. Yangzhou: Yangzhou University， 2015. (in Chinese with English abstract)

[8] NIKOLICH-ZUGICH J， DAVED H F， MICHAEL J M. The role of MHC polymorphism in anti-microbial resistance[J].MicrobesandInfection， 2004， 6(5): 501-512.

[9] TOUSSIROT E， SAUVAGEOT C， CHABOD J. The association of HLA-DM genes with rheumatoid arthritis in Eastern France[J].HumanImmunology， 2000， 61(3): 303-308.

[10] 桑艳梅，颜纯. HLA-DMA及DMB基因与1型糖尿病相关性的研究进展[J]. 国际内分泌代谢杂志， 2005， 25(2): 78-80. SANG Y M， YAN C. The association of HLA-DMA， DMB gene polymorphism with type 1 diabetes[J].ForeignMedicalSciencesSectionofEndocrine， 2005， 25(2): 78-80. (in Chinese with English abstract)

[11] MOREL J， ROCHBRAS FMOLINARI N， SANY J， et al. HLA-DMA*0103 and HLA-DMB*0104 alleles as novel prognostic factors in rheumatoid arthritis[J].AnnalsoftheRheumaticDiseases， 2004， 63 (12): 1581-1586.

[12] 磨美兰，杨汉春，郭鑫，等. 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对猪肺泡巨噬细胞外源性抗原加工递呈相关分子和共刺激分子的影响[J]. 畜牧兽医学报， 2007， 38(6): 568-573. MO M L， YANG H C， GUO X， et al. Effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection on the molecules associated with processing and presentation function of porcine pulmonary alveolar macrophages for exogenous antigen and costimulatory molecules[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica， 2007， 38(6): 568-573. (in Chinese with English abstract)

(责任编辑 张 韵)

Comparative analysis ofDMAgene sequences in different chicken breeds

KONG Linglin， ZHENG Shenghan， CHEN Ying， ZHU Pengfei， WU Yun， GUO Qixin， CHEN Guohong， CHANG Guobin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

DMA(major histocompatibility complex， class Ⅱ， DM alpha) is a typical gene of chicken MHC class Ⅱ， which is closely related to the host immune response and disease resistance. In this study， we detectedDMAgene of 25 different chicken breeds by target capture sequencing and usedDMAgene sequence ofGallusgallusin NCBI as the reference. Then we analyzed gene sequence by MEGA6， screened SNPs (single nucleotide polymorphism) and Indels (insertion-deletion) ofDMAgene sequences in different chicken breeds. Finally， we constructed the phylogenetic tree according to the differences in gene sequences. The results revealed that theDMAgene appeared rich polymorphism. SNPs and Indels were concentrated on exons mostly. Meanwhile， base deletions on exon2 caused the great changes in its translated products. In addition， the phylogenetic tree showed the chickens with better disease resistance such as Tibetan chicken and game chicken had high homology. The above results demonstrated that theDMAgene is rich in genetic diversity which is related to the differences in innate immunity and disease resistance in chicken breeds. The Indels in exon 2 94 496-94 552 can be used as a candidate marker of chicken immune characteristics.

chicken;DMAgene; MHC; SNPs; Indels; phylogenetic tree

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.07

2016-11-02

国家科技支撑计划(2015BAD03B03)；江苏高校优势学科建设工程资助项目

孔令琳(1994—)，女，江苏扬州人，硕士研究生，从事家禽遗传育种研究。E-mail:1921714112@qq.com

*通信作者，常国斌，E-mail: passioncgb@163.com

S831

A

1004-1524(2017)04-0560-06

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 560-565

孔令琳，郑圣晗，陈颖，等. 不同鸡种DMA基因序列比较分析[J].浙江农业学报，2017，29(4)： 560-565.