福建省延平区及永安市致泻性大肠埃希菌监测分析

杨劲松，郑恩惠，林 杰，罗朝晨，陈爱平



福建省延平区及永安市致泻性大肠埃希菌监测分析

杨劲松1,2，郑恩惠1，林 杰1，罗朝晨1，陈爱平1,2

目的 掌握福建省腹泻患者致泻性大肠埃希菌(diarrheagenicEscherichiacoli, DEC)的流行特征，为防控腹泻病的流行和爆发提供依据。方法 搜集2010-2015年延平区和永安市哨点医院腹泻病标本1 950份，接种于麦康凯( MaC) 培养基，挑选平板上粉红色、光滑型菌落，采用常规分离培养和分子诊断技术相结合的方法分离鉴定致泻性大肠埃希菌，用SPSS 17.0对结果进行统计分析。结果 致泻性大肠埃希菌共检出129株，总检出率为6.62%；EPEC检出65株，检出率为3.33%，其中aEPEC 61株，tEPEC4株；ETEC和EAEC均检出32株，检出率为1.64%；未检出EHEC和EIEC。男女DEC检出率差异无统计学意义(P>0.05)；将腹泻患者按照年龄分为5组，DEC检出率分别为7.03%、4.60%、3.70 %、7.28%和6.21%，各组EPEC、ETEC和EAEC检出率差异无统计学意义(P>0.05)。致泻性大肠埃希菌(DEC)检出率最高的月份为8月和9月；农村和城市DEC检出率差异无统计学意义(P>0.05)；两地区各类型DEC构成比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 福建省DEC 存在3 种类型，以EPEC为主(其中aEPEC占绝对优势)，8、9月是DEC高发月份，0～5岁婴幼儿组及成人组是DEC的高发人群，合理使用抗生素治疗DEC需要得到重视。

致泻性大肠埃希菌;多重PCR;流行特征

致泻性大肠埃希菌(diagrrheagenicEscherichiacoli，DEC)是一类能引起5岁以下儿童急性腹泻的重要病原菌，尤其在发展中国家具有较高的发病率和病死率，每年全球儿童因腹泻死亡的病例占到儿童死亡总数的19%[1-2]。近年来，致泻性大肠埃希菌在成人腹泻病患者中检出明显增加，发达国家的疾病负担也不断加重。根据毒力因子、致病机制、临床表现和流行病学特征，主要将其分为6 类，包括肠致病性大肠埃希菌( EPEC)、肠产毒性大肠埃希菌( ETEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌( EHEC)或产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)、肠集聚性大肠埃希菌(EAEC) 和弥散黏附性大肠埃希菌(DAEC)[3-4]。致泻性大肠埃希菌引起的腹泻归为其它感染性腹泻，属于法定报告的丙类传染病。但致泻性大肠埃希菌的诊断不能单独依靠血清生化，需借助分子生物学方法来鉴定，因此在基层医疗和疾控机构开展存在难度。为了解感染性腹泻病原菌的本底水平，掌握DEC的分布特征和流行趋势，为预防和控制感染性腹泻的暴发与流行提供依据，福建省于2010年设立南平延平区和三明永安市作为监测点开展其它感染性腹泻( 细菌性) 监测工作，现将2010—2015年的监测结果进行报告和分析。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2010—2015年5—11月从2个监测点(福建省延平区、永安市)的哨点医院采集腹泻患者粪便标本1 950份。

1.2 试剂与仪器 麦康凯培养基、LB培养基购于北京陆桥技术有限责任公司； API 20E 生化鉴定条(法国生物-梅里埃公司)；致泻性大肠埃希菌诊断血清(宁波天润生物药业有限公司)；PCR反应试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；琼脂糖为BioAsia 进口分装品，G-Storm PCR 扩增仪为英国Gene Tech公司产品；5种致泻性大肠埃希菌多重PCR检测试剂盒(北京卓诚惠生公司)；电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYY-6C 型，Molecular Imager Gel Doc XR+ System凝胶成像分析系统购自美国Bio-rad公司；引物由上海生工有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离和挑选 将腹泻患者(24 h内大便次数≥3次，并伴有粪便性状改变，大便镜检异常) 新鲜粪便标本直接接种于麦康凯培养基，37 ℃培养18 h，每份平板挑选5个疑似大肠埃希菌菌落(粉红色、半透明、光滑、湿润、微隆起)。分别穿刺接种克氏双糖(KIA)和动力/吲哚/尿素培养基(MIU)，于37 ℃培养24 h。符合大肠埃希菌生化反应特性的菌株进一步进行PCR检测。

1.3.2 多重和单重PCR检测 提取可疑菌落的DNA，运用多重PCR方法进行初筛，相关基因筛查结果为阳性的标本挑单克隆再用分子诊断技术进行确认，阳性的菌株进一步进行API 20 E生化及血清凝集实验。PCR检测的相关基因如下：EPEC/EHEC的eaeA(escV)基因、EHEC的stx基因、EAEC的aggR、pic和astA基因、EIEC的invE和virA基因、ETEC的ST和LT基因[5-6]。

1.3.3 典型EPEC(tEPEC)与非典型EPEC(aEPEC)的鉴别 将eaeA(escV)基因阳性的菌株，进一步用PCR扩增bfp基因，以区分tEPEC与aEPEC，bfp基因阳性的为tEPEC。PCR引物及扩增条件参见文献[5]。5种致泻性大肠埃希菌PCR结果判定见试剂盒说明书。

1.3.4 资料分析 运用SPSS 17.0对结果进行统计分析，率和构成比的比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 菌株及毒力基因检出情况 共检测粪便标本1 950份，检出5种致泻性大肠埃希菌 129株，总检出率为6.62%。EPEC共检出65株(其中aEPEC 61株，tEPEC 4株)，检出率为3.33%；ETEC和EAEC均检出32株，检出率为1.64%；未检出EHEC和EIEC。129株阳性病例中以EPEC感染为主，占到50.39%，ETEC和EAEC感染构成比为24.81%，也占到相当大比重。另外有2份标本同时分离到aEPEC和ETEC，1份同时分离到aEPEC和EAEC，1份同时分离到EAEC和ETEC；1例患者在6个月内先后检出1次aEPEC和2次EAEC，1例患者在1个月内2次检出aEPEC。

2.2 性别分布 1 950例腹泻患者中，男性1 115例，女性835例，DEC检出率分别为6.37%(71/1 115)和6.95%(58/835)，男女检出率差异无统计学意义(χ2=0.259，P=0.611)。

表1 不同年龄组DEC及各相关病原菌的检出情况

Tab.1 Detection of DEC in different age groups

年龄组Agegroups(year)标本数Samples菌株数Strains(%)EPECETECEAEC菌株数Strains%菌株数Strains%菌株数Strains%0～68448(7．02)253．6591．32142．055～1748(4．60)63．4510．5710．5710～813(3．70)11．2311．2311．2320～67349(7．28)243．57131．93121．7860～33821(6．21)92．6682．3741．18

2.4 时间分布 DEC检出率最高的月份为8月，其次是9月,见表2。

表2 2010—2015年5—11月DEC相关病原菌检出情况

Tab.2 Detection of DEC from May to November, 2010—2015

年份year5月May6月June7月July8月August9月September10月October11月November标本数(检出率%)Samples(Detectionrate%)201001110331307(6．19)20110226100360(3．06)201213220900288(12．15)20130342170320(5．31)20146816203340(7．65)20150497100335(6．27)标本数Samples244334433411263195701950检出率Detectionrate%2．876．294．3912．416．465．135．716．62

2.5 地区和地域分布 农村患者513例，检出 DEC 36株，检出率7.02%；城市患者1 437例，检出DEC 93株，检出率6.47%，差异无统计学意义(χ2=0.182，P=0.669)。延平区和永安市DEC检出率分别为8.14%(78/958)和5.14%(51/992)，两地区各类型DEC构成比差异无统计学意义(χ2=5.311，P=0.150)。详见表3。

表3 不同地区DEC检出率和各类型菌株构成比(n/%)

Tab.3 Detection rates and constituent ratio of DEC in different areas (n/%)

地区Areas标本数Samples菌株数(检出率%)Strains(Detectionrate)菌株数(百分比%)/Strains(Percentage%)aEPECtEPECEAECETEC延平95878(8．14)41(52．56)3(3．84)14(17．95)20(25．64)永安99251(5．14)20(39．22)1(1．96)18(35．29)12(23．53)

3 讨 论

福建省在上世纪80年代采用分离培养法对腹泻人群中的DEC进行监测，总检出率为27.8%，其中ETEC、EPEC和EIEC分别为20.2%、6.3%和1.3%[7],90年代后开展的监测工作较少，流行背景不明。随着社会经济发展，DEC病原菌在人群中的分布可能发生变迁，因此有必要摸清DEC的分布状况和流行态势。近年来，全国各地DEC监测结果不断报道，各地检出率在6%～12%之间，不同地区的优势菌型不同，宁夏地区、河南省以EPEC为主，新疆乌鲁木齐市以ETEC为主，而沈阳市和贵阳市则以EAEC为主[8-12]。本次监测结果显示DEC总检出率为6.62%，EPEC、ETEC和EAEC分别占检出率的前3位，与宁夏、河南的监测结果相似，但与本省上世纪80年代监测结果有较大差异，一是检出率大幅下降，二是优势菌型由ETEC变为EPEC。出现这种变化可能的原因一是经济条件、文化程度的提高以及健康状况、卫生习惯改善会减少致泻性大肠埃希菌的感染。二是30多年前致泻性大肠埃希菌主要依靠血清鉴定、致病因子检测等常规方法，特异度不高；随着分子生物学技术的发展，目前主要运用PCR方法检测特异的毒力基因，特异度有明显提高。分子生物学诊断手段与常规方法的有机结合,是今后公共卫生事件实验室调查的一个有力手段[13]。三是不少患者在就诊前已服用抗生素，导致检出率下降。

以往资料显示，各型DEC引起的感染性腹泻在年龄大小、季节变化、地区分布存在一定的差异，婴幼儿、年老体弱者及旅游者感染率较高。EPEC主要引起婴幼儿或<5岁的儿童腹泻；ETEC对成人和小孩均可致病，多表现为“旅游者腹泻”；EAEC主要与小儿顽固性腹泻有关。本次研究结果显示，DEC检出率在性别、地区和地域方面无明显差异；各年龄组EPEC、ETEC和EAEC的检出率也无明显差异，有可能受到标本来源和数量的影响，但也有可能这3种DEC在我省的流行病学分布规律发生了变化，应该予以足够重视。DEC在夏季8、9月份检出率较高，符合细菌性腹泻病的季节发病规律。

福建省DEC的优势菌型已变迁为EPEC，尤其是aEPEC占到相当大比重，这是一种新型致病菌。aEPEC较tEPEC更有可能携带其它DEC致病类型中编码毒力因子的基因，包括一些毒素、蛋白酶和粘附素等，甚至来自EHEC质粒的基因。近年来全球各地汇总的资料表明在发展中国家和发达国家，aEPEC都比tEPEC更为流行[14]。 tEPEC的唯一宿主是人，而aEPEC的宿主可以是人和动物，由于aEPEC存在健康携带者和动物贮存宿主，并且动物活体带菌率相当高，已波及肉、蛋制品，故加强本底调查有助于阐明动物贮存宿主在aEPEC引起人类疾病中所发挥的作用，今后需要广泛开展aEPEC在外环境及食品中的监测。

EAEC不仅是发展中国家也是发达国家儿童腹泻，特别是持续性腹泻的重要病原，可以引起儿童脱水、营养不良，甚至死亡。本次监测结果发现EAEC在我省检出率较高，并有2例婴幼儿出现EAEC的持续性感染，原因可能是未选用敏感抗生素治疗所致。郭邦成等对分离自宁夏地区的98株DEC进行药敏分析，结果显示分离菌株对10种常用抗生素均产生较高的耐药性[8]。因此加强对细菌性腹泻患者的治疗应尽早确定病原种类和开展药敏试验，有针对性地使用抗生素，做到有的放矢，避免仅凭经验用药造成腹泻迁延不愈而引发其它并发症。

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Chen Ai-ping, Email：cap2006@live.cn

Surveillance of diarrheagenicEscherichiacoliinfection in Yanping and Yongan, Fujian Province, China

YANG Jin-song1,2, ZHENG En-hui1, LIN Jie1, LUO Chao-chen1, CHEN Ai-ping1,2

(1.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China; 2.KeyLaboratoryofFujianProvinceforZoonoticDiseaseResearch,Fuzhou350001,China)

We investigated the epidemiological characteristics of diarrheagenicEscherichiacoli(E.coli) infection in Fujian Province, providing reference for the prevention and control of diarrhea epidemic and outbreak. Yanping and Yongan areas were selected as surveillance sites from year 2010 to 2015, where 1 950 samples were collected from the sentinel hospitals, and then samples were isolated and cultured on MacConkey agar plates. Suspected strains were identified by routine and molecular diagnosis technique methods. Results were analyzed by SPSS 17.0 software package. A total of 129 strains of diarrheagenicE.coliwere isolated with a total detection rate of 6.62%. The detection rates of enteropathogenicE.coli(EPEC), enterotoxigenicE.coli(ETEC) and enteroadhesiveE.coli(EAEC) were 3.33%, 1.64% and 1.64% respectively (including 61 strains of atypical EPEC, 4 strains of typical EPEC, and 32 strains of ETEC and EAEC for each), while EHEC and EIEC were not found. There was no significant difference between the detection rates of male and female. All the patients were divided into five groups according to the age, and there were no significant differences between the detection rates of EPEC, EAEC and ETEC in the 5 groups. The detection rates were the highest in August and September. There was no significant difference between the detection rates of rural area and uban area. There was also no significant difference between the composition ratio of diarrheagenicE.coli(DEC) in the two surveillance sites. In conclusion, there were three kinds of DEC in Fujian Province, and EPEC was the dominant. August and September were the months with the highest detection rates. Children age less than five and adult aged 20—59 years were the high-risk groups with DEC infection. More attention should be attached on the rational treatment by antibiotic for DEC.

diarrheagenicEscherichiacoli; multiplex-PCR; epidemiological characteristics

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.012

陈爱平，Email：cap2006@live.cn

1.福建省疾病预防控制中心，福州 350001； 2.福建省人兽共患病研究重点实验室，福州 350001

Supported by the Fujian Provincial Medical Innovation Project (No. 2011-CXB-19)

R378.21

A

1002-2694(2017)04-0353-04

2016-10-14 编辑：梁小洁

福建省医学创新课题(No.2011-CXB-19)资助